Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio Fondazione Nazionale della Scienza Graduate Research di SK e National Institutes of Heath concedere R01EB008722.

A. La preparazione dei materiali e sterilizzazione <ol><li> Prima di materiali di incapsulamento preparazione, preparare una soluzione 0,5% in peso del fotoiniziatore Irgacure 2959 (I2959) in tampone fosfato salino (PBS), mixando e incubazione per diversi giorni a 37 ° C. La soluzione può allora essere filtrati siringa per la sterilizzazione e conservati a temperatura ambiente per un utilizzo a lungo termine. </li><li> Sulla base della composizione desiderata di gel da sintetizzare, calcolare (usando un foglio di calcolo come Microsoft Excel) il peso di polimero e reticolante necessario. Perché un dato peso di polimero deve essere sciolto in un determinato volume totale per ottenere una concentrazione desiderata in idrogel, il reticolante e porzioni soluzione di polimero del volume gel totale deve essere determinato anche utilizzando il foglio di calcolo. Calcoli simili dovrebbero essere eventuali frazioni di sospensione (ad esempio, un adesivo o RGD YGSR contenenti oligopeptide) devono essere inseriti prima di reticolazione. </li><li> Pesare la quantità di polimero e reticolante e il luogo in tubi Eppendorf. Regolare il foglio di calcolo di conseguenza per il peso effettivo del polimero ottenuto. (Nota: i volumi possono essere modificati per compensare la massa effettiva del polimero reticolante e ottenuto). </li><li> Preparare gli stampi gel utilizzando una lama di rasoio per tagliare le cime via di confezione singola sterile monouso siringhe da 1 ml. Garantire un taglio piatto è fatto per stampi da utilizzare per i gel photopatterned. </li><li> Mettere gli stampi siringa, provette Eppendorf (con tappi aperto) e qualsiasi altro materiale necessario, sotto una fonte di luce germicida (tipicamente integrato in cappe di sicurezza biologica) e sterilizzare per 30 minuti. </li></ol> B. Preparazione cellulare <ol><li> Dopo la sterilizzazione, aggiungere il giusto volume di tampone sterile (per calcoli di foglio di calcolo, mentre la scelta del buffer può variare, PBS e un buffer di base debole come trietanolammina sono tipicamente utilizzati per la reticolazione radicali liberi e michael-tipo, rispettivamente) alla Eppendorf polimero e (opzionalmente) porzione ciondolo da inserire (per esempio, adesivi peptide) e vortice di sciogliere (se al di fuori del vortex avvolgere la cappa sterile Eppendorf con parafilm). </li><li> Aggiungere il volume appropriato di soluzione porzione pendant alla soluzione di polimeri e avvolgere il sigillo con parafilm. Mescolare brevemente nel vortex e incubare a 37 ° C a reagire (se possibile, in cima a un piatto mescolare rotante) durante la preparazione delle cellule. Questo implica la reazione di un tiolo su un peptide (via gruppo cisteina) ad un acrilato o metacrilato in modo che il peptide è incluso come un gruppo ciondolo in idrogel finale. </li><li> Trypsinize e contare le cellule e si separano in porzioni contenenti il ​​numero appropriato per ogni set di gel. Ad esempio, per una serie di tre da 50 microlitri gel ad una densità di 10 milioni di cellule / ml, 1,5 milioni separato le cellule in una provetta conica individuale. Si raccomanda di non più di 4 gel essere preparati in un set singolo a causa della tempistica di gelificazione (nota: se sintetizzare più set di gel, un singolo Eppendorf contenente un adeguato volume di soluzione polimerica per tutti i set possono essere preparati). </li><li> Centrifugare le cellule. </li><li> Mentre le cellule girano verso il basso <ol class="lalpha"><li> Luce iniziata reticolazione radicali liberi: aggiungere 0,5% in peso I2959 soluzione alla soluzione di polimeri pari al 10% del volume totale di gel (per una concentrazione finale iniziatore dello 0,05% in peso). </li><li> Michael-type (aggiunta) reticolazione: aggiungere buffer nel reticolante per ottenere la soluzione adeguata concentrazione. </li><li> Per reticolazione sequenziali: questi gel incorporare entrambi i tipi di reticolazione e richiedono entrambi i passaggi precedenti. </li></ol></li></ol> C. Hydrogel Formazione <ol><li> Aspirare il surnatante dalla parte delle cellule centrifugato. Attendere il liquido di stabilirsi dopo l&#39;aspirazione iniziale e ri-aspirare a rimuovere il supporto quanto più possibile senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet cellulare con la soluzione di polimero fino cellule sono uniformemente distribuite. Minimizzare la formazione di bolle lentamente pipettaggio la soluzione su e giù (circa 10 cicli dovrebbe essere sufficiente per distribuire le cellule). </li><li> Reticolazione idrogel <ol><li> Luce iniziata radicali liberi reticolazione: Distribuire il volume appropriato in stampi siringa. Esporre le siringhe ai raggi UV per la reticolazione radicale (ad esempio, una esposizione 10 minuti a 365 nm, 4 mW/cm2 luce UV è comune per i polimeri funzionalizzati acrilato). Questa operazione deve essere eseguita rapidamente per ridurre al minimo delle cellule assestamento prima dell&#39;esposizione ai raggi UV. </li><li> Michael-type (aggiunta) reticolazione: Utilizzando un ampio orifizio punta della pipetta, aggiungere il volume appropriato di soluzione reticolante al polimero / cella soluzione, impostare la pipetta per il volume desiderato gel individuali, pipetta la soluzione su e giù peromogeneizzare e aliquote in stampi pendere l&#39;ago della siringa. Questa operazione deve essere eseguita rapidamente per garantire una distribuzione uniforme delle celle. Lasciare 10-30 minuti (a seconda del sistema individuale) di incubazione nel cappuccio cultura per reticolazione. </li><li> Reticolazione sequenziale: si tratta di Michael-tipo di reazione di addizione e poi l&#39;esposizione alla luce per la reticolazione secondo. Solo una frazione di legami crociati teorica dovrebbe essere reagito durante la reticolazione e poi una mascherina sterile deve essere applicato direttamente sulla superficie del gel prima di esposizione alla luce utilizzando una pinzetta sterilizzata. Un colorante funzionalizzati (ad esempio, rodamina methacrylated (MeRho) ad una concentrazione finale nel gel di 20 Nm) può anche essere aggiunto alla soluzione iniziale per visualizzare il modello, dato che incorporano preferenzialmente nelle regioni radicalmente reticolato del gel (Figura 2 ). </li></ol></li></ol> D. coltura cellulare e analisi <ol><li> A seguito di reticolazione, gel immergersi in pozzetti di una piastra di coltura di tessuti contenenti i media per l&#39;incubazione e l&#39;analisi (vedere i passaggi seguenti). </li><li> Le celle possono essere visualizzati per la morfologia con microscopia ottica (figura 3, in genere, gli idrogel sintetizzati sono trasparenti) e la vitalità usando un fluorescente live / morti kit di colorazione (figure 3 e 4). Colorazione per cellulari actina (ad esempio, rodamina o marcate con fluoresceina falloidina) e nuclei (ad esempio, 4&#39;-6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI)) possono essere eseguite utilizzando la fissazione e procedure standard permeabilizzazione (Figura 4) con la seguente procedura. <ol class="laplha"><li> Sciacquare costruisce 3X per 5 minuti con PBS. </li><li> Fix gel mediante incubazione in 1 ml di formaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare costruisce 3X con una soluzione di blocco contenente il 3% (w / v) di BSA e 0,5% (w / v) Tween in PBS. </li><li> Permeabilize membrana con 0,25% (w / v) Triton X nel bloccare la soluzione per 20 min. </li><li> Sciacquare costruisce 3X con il blocco soluzione. </li><li> Macchia di F-actina con 0,66 mg / ml FITC o rodamina falloidina nel bloccare una soluzione per due ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare 3x con blocco soluzione. </li><li> Macchia nuclei cellulari utilizzando 0,4 microlitri / ml DAPI in PBS per 20 min. </li><li> Sciacquare 3X con PBS. </li><li> Visualizzare le cellule usando la microscopia confocale o epifluorescente. </li></ol></li><li> Proliferazione di cellule all&#39;interno di gel viene comunemente valutata mediante test disponibili in commercio (ad esempio, DNA totale o contenuti biochimici). PicoGreen è un uso comune e sensibile acidi nucleici colorante fluorescente per quantificare il DNA a doppia elica (Singer et al.). Le cellule possono anche essere contati e normalizzato ad un numero iniziale di controllo utilizzando i metodi di visualizzazione descritto al punto 2. </li><li> Sezionamento istologici e colorazione può essere utilizzato anche per visualizzare cellule e formano matrice. Il protocollo seguito per la disidratazione e il sezionamento di idrogeli 3D possono essere utilizzate per ottenere sezioni trasversali su vetrini: <ol class="lalpha"><li> Fissazione e la disidratazione <ol class="lroman"><li> Sciacquare campione 3 volte in PBS. </li><li> Fix per 5 - 30 minuti in paraformaldeide 4%. </li><li> Sciacquare campione 3 volte in PBS. </li><li> Incubare campione in EtOH a 25 ° C per 1 ora a ciascuno dei seguenti EtOH (v / v) le concentrazioni in acqua (in ordine): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (A questo punto, i campioni può essere conservato durante la notte a 25 ° C). </li></ol></li><li> Compensazione e infiltrazione <ol class="lroman"><li> Trasferimento% Citrisolv 100 per 1 ora a 25 ° C, seguita da un&#39;ora a 65 ° C. </li><li> Tagliare a metà i campioni con una lametta in una piastra di Petri in modo tale che la sezione trasversale del campione è esposto. </li><li> Trasferimento in miscela 1:1 di Citrisolv / Micro-taglio di paraffina per 1 ora a 65 ° C. </li><li> Trasferimento al 100% Micro-taglio di paraffina per 1 ora a 65 ° C. </li><li> Trasferimento al 100% Micro-taglio paraffina notte a 65 ° C. </li><li> Trasferimento al 100% Micro-taglio di paraffina per 1-2 ore a 65 ° C. </li></ol></li><li> Incorporare <ol class="lroman"><li> Posizione nel campione peel-away stampo con il 100% paraffina. </li><li> Mettete una piccola quantità di cera a letto stampo, e inserire le due metà del campione con la sezione rivolta verso il basso. </li><li> Applicare top pezzo filtro <ol><li> Aggiungi cera aggiuntive per immergere il pezzo superiore e lasciare indurire per circa 10 minuti. </li></ol></li><li> Trasferimento inserti frigorifero a 4 ° C per consentire provino per indurire durante la notte. </li><li> Campione può essere sezioneed il giorno seguente, di solito a spessore micron 5-10 per fetta utilizzando microtomi disponibili in commercio. In genere il peel-away stampo è montato verticalmente contro il palco microtomo e controlli manuali consentono di impostare lo spessore della sezione, affettatrice e l&#39;allineamento del campione con la lama. </li></ol></li><li> Estrazione di RNA L&#39;espressione genica può anche essere valutata quantitativamente (ad esempio tramite real-time polymerase chain reaction (PCR)). Il protocollo per l&#39;estrazione di RNA da idrogel 3D, un esempio è riportato di seguito, è molto diverso dal caso più semplice 2D. <ol class="lroman"><li> Etichettare un certificato RNasi libero provetta Eppendorf per ogni idrogel 3D e aggiungere 500 microlitri Trizol ® reagente ad ogni provetta. </li><li> Utilizzare un pestello (grinder tessuto) per macinare manualmente l&#39;idrogel fino a quando una soluzione limpida ottenuta. Smerigliatrici garantire diversi sono utilizzati per ogni condizione. </li><li> Vortex ogni Eppendorf per 20 secondi per omogeneizzare i campioni. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti per consentire completa dissociazione dei complessi nucleoproteina. </li><li> Refrigerare i campioni in ghiaccio per 20 minuti </li><li> Aggiungere 200 ul (per mL Trizol) cloroformio per ogni campione e vortice. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti. </li><li> Centrifugare i campioni a 12000 xga 4 ° C per 15 min. </li><li> Trasferire la fase acquosa (chiaro strato superiore) a nuovi tubi Eppendorf (evitando regione interfacciale e inferiore rosso, fenolo-cloroformio fase). RNA rimane nella fase acquosa limpida. </li><li> Tecniche comuni per l&#39;isolamento di RNA e storage possono ora essere utilizzati. </li><li> Dopo l&#39;estrazione di RNA, i kit disponibili in commercio per la trascrittasi inversa e PCR in tempo reale sono spesso utilizzati con alcune modifiche (Elisseff et al. Strehin et al.). </li></ol></li></ol></li></ol> Rappresentante dei risultati: Si vedano le figure 2-4 (come indicato nei protocolli di cui sopra) per ottenere risultati rappresentativi della visualizzazione di idrogel photopatterned e incapsulamento di cellule all&#39;interno gel. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Panoramica della procedura di incapsulamento 3D. Passi diagramma corrispondono ai titoli delle sezioni dei protocolli graduale. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Photopatterned idrogel con Michael sequenziale di tipo polimerizzazione per addizione poi radicale. (A) Schema di photopatterning di un idrogel parzialmente reticolato con l&#39;incorporazione di un colorante reattivo foto. (B) Circle o (C) maschera di trasparenza striscia film di fantasia idrogel di acido ialuronico. Rodamina Methacrylated (MeRho) è incorporato soltanto nelle regioni del gel che sono stati esposti alla luce. Barre di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Visualizzazione di cellule in idrogel 3D. Le cellule staminali visualizzati tramite (a) microscopia ottica o (b) dal vivo (verde, calceina AM) e morti (rossi, etidio omodimero-1) colorazione 24 ore dopo l&#39;incapsulamento a 1 milione di cellule / ml in un idrogel di acido ialuronico reticolato con il semaforo iniziato meccanismo radicali liberi. Barre di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Visualizzazione di cellule in idrogel 3D. hMSCs macchiato per (a) cellule vive (calceina AM) o (b) cellulari actina (rodamina falloidina) e nuclei (DAPI) cinque giorni dopo l&#39;incapsulamento a 1 milione di cellule / ml in un idrogel di acido ialuronico reticolato attraverso un meccanismo di tipo Michael ( utilizzando peptidi adesivi pendente e bifunzionali reticolanti peptide proteoliticamente degradabili). Barre di scala = 100 micron.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

I protocolli descritti rappresentano un metodo semplice ed efficace per incapsulare le cellule all&#39;interno di ponteggi idrogel in modo cytocompatible. Tali tecniche sono particolarmente importanti poiché terminalmente differenziate e le cellule staminali possono manifestare un comportamento marcatamente diverso in microambienti 2D vs 3D. Anche per approcci terapeutici che coinvolgono l&#39;impianto di materiali (ad esempio, a polimerizzazione in situ radicale), l&#39;incapsulamento delle cellule e di analisi per la vitalità e la differenziazione può aiutare nel processo di sviluppo materiale. Il processo descritto sequenziale può essere usato per manipolare l&#39;ambiente spazialmente idrogel, e di conseguenza il comportamento cellulare (vedi Khetan et al.). In generale, l&#39;elemento più critico dei protocolli descritto è l&#39;omogeneità di tutte le soluzioni utilizzate. In particolare, particolare attenzione deve essere adottate per garantire le cellule siano uniformemente distribuite nella soluzione prepolimero, e che la soluzione è ben mixato da risospensione pipetta seguente aggiunta della soluzione di reticolante. Non riuscire a garantire questo può portare ad aggregazione di cellule o di variazioni locali della struttura del gel e gonfiore. Mentre i protocolli qui presentati si concentrano principalmente sulla procedura per le cellule incapsulamento, è importante notare anche che l&#39;incapsulamento può richiedere alcuni aggiustamenti per protocolli di analisi che in genere sono scritti per la semina 2D. Numerosi esempi sono stati illustrati per la visualizzazione e la valutazione delle cellule in idrogel.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.2 M Triethanolamine Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0449</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>1x, sterile liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead staining kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine Phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Citrisolv</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-143975</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-cut paraffin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>24202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizol reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.22 &mu;m pore size nylon syringe filters</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>09-719C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 mL disposable syringes</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td>
</tr>
<tr>
<td>Wide orifice pipette tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>254 nm germicidal UV light source</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Built into most biological safety cabinets</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

L&#39;incapsulamento 3D di cellule all&#39;interno idrogel rappresenta una tecnica sempre più importante e popolare per la coltura delle cellule e verso lo sviluppo di costrutti per l&#39;ingegneria tissutale. Questo ambiente riproduce meglio ciò che osservare le cellule in vivo, rispetto alla cultura dei tessuti standard, a causa del tessuto simil-proprietà e ambiente 3D. Idrogel polimerici sintetici sono gonfi d&#39;acqua le reti che possono essere progettati per essere stabili o di degradare tramite idrolisi o proteolisi come nuovo tessuto viene depositato dalle cellule incapsulate. Una vasta gamma di polimeri sono stati esplorati per queste applicazioni, come la poli (glicole etilenico) e acido ialuronico. Più comunemente, il polimero è funzionalizzato con gruppi reattivi come metacrilati o acrilati poter subire una reticolazione attraverso vari meccanismi. Negli ultimi dieci anni, molti progressi sono stati fatti nel campo dell&#39;ingegneria questi microambienti - ad esempio, tramite l&#39;incorporazione fisica o ciondolo covalente di segnali biochimici - fenotipo cellulare per migliorare la viabilità e diretto, tra cui la differenziazione delle cellule staminali incapsulate (Burdick et al.). I seguenti metodi per l&#39;incapsulamento 3D delle cellule sono stati ottimizzati nel nostro ed altri laboratori per massimizzare citocompatibilità e minimizzare il numero di fasi di lavorazione idrogel. Nei protocolli seguenti (vedi Figura 1 per l&#39;illustrazione della procedura), si assume che i polimeri funzionalizzati in grado di subire reticolazione sono già in mano, ottime recensioni della chimica dei polimeri, applicato al campo della ingegneria dei tessuti possono essere trovati altrove (Burdick et al.) e questi metodi sono compatibili con una vasta gamma di tipi di polimeri. Inoltre, l&#39;aggiunta Michael-tipo (vedi Lütolf et al.) E la luce iniziati radicali liberi (vedi Elisseeff et al.) Meccanismi concentrati qui costituiscono solo una piccola parte delle tecniche di reticolazione segnalati. Reticolazione modalità mista, in cui una parte di gruppi reattivi viene prima consumato da oltre reticolazione e seguita da un meccanismo radicale, è un altro paradigma comunemente utilizzati e potenti per dirigere il fenotipo delle cellule incapsulate (Khetan et al. Salinas et al.).

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Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Vi presentiamo i protocolli per le 3 dimensioni (3D) incapsulamento delle celle all&#39;interno di idrogel sintetico. La procedura di incapsulamento viene delineato per due metodi comunemente usati di reticolazione (michael-tipo di addizione e di luce iniziata meccanismi di radicali liberi), come pure una serie di tecniche per la valutazione del comportamento delle cellule incapsulate.

Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l&#39;ingegneria tissutale

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.7K Views.  University of Pennsylvania. Vi presentiamo i protocolli per le 3 dimensioni (3D) incapsulamento delle celle all'interno di idrogel sintetico. La procedura di incapsulamento viene delineato per due metodi comunemente usati di reticolazione (michael-tipo di addizione e di luce iniziata meccanismi di radicali liberi), come pure una serie di tecniche per la valutazione del comportamento delle cellule incapsulate.

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Experimental Approaches to Tissue Engineering

Approcci sperimentali di ingegneria dei tessuti

Ricerca

Biologia

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titolo Incapsulamento cella di goccioline

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Electrospinning Ponteggi polimeri fibrosi per l&#39;ingegneria tissutale e colture cellulari

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these models utilize reconstituted basement membrane derived from animals which contain a variable amount of growth factors and cytokines that can influence the growth of these cell culture models. Here, we describe in detail the preparation and use of PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel that is devoid of animal-derived material and pathogens to encapsulate and propagate the ovarian cancer cell line, OVCAR-5. We begin by describing how to prepare the PuraMatrix prior to use. Next, we demonstrate how to properly mix the PuraMatrix and cell suspension to encapsulate the cells in the hydrogel. Upon the addition of cell culture media or injection into a physiological environment, the peptide component of PuraMatrix rapidly self assembles into a 3D hydrogel that exhibits a nanometer scale fibrous structure with an average pore size of 5-200 nm1. In addition, we demonstrate how to propagate cultures grown in encapsulated PuraMatrix. When encapsulated in PuraMatrix, OVCAR-5 cells assemble into three dimensional acinar structures that more closely resemble the morphology of micrometastatic nodules observed in the clinic than monolayer in vitro models. Using confocal microscopy we illustrate the appearance of representative OVCAR-5 cells encapsulated in PuraMatrix on day 1, 3, 5, and 7 post plating. The use of PuraMatrix to culture cancer cells should improve our understanding of the disease and allow us to assess treatment response in more clinically predictive model systems.

This video demonstrates how to encapsulate and culture cancer cells in PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel.

Incapsulamento PuraMatrix delle cellule tumorali

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

La stimolazione meccanica di condrociti-agarosio idrogel

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

Preparazione di DNA-reticolato poliacrilammide idrogel

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...