Questo protocollo fornisce una piattaforma di coltura cellulare in cui le proprietà della matrice extracellulare come rigidità, composizione proteica e morfologia cellulare possono essere controllate con precisione in modo economico e facile. Il metodo è conveniente e non richiede una formazione o strutture speciali. È anche compatibile con più metodi di quantificazione cellulare come la colorazione immunofluorescente e la macchia occidentale.
Questa tecnica fornisce una comprensione meccanicistica della biologia cellulare di Schwann. Con ulteriori informazioni sul design dei biomateriali per la rigenerazione del sistema nervoso, può essere applicato a qualsiasi cellule dipendenti dall'ancoraggio. La parte più impegnativa di questo protocollo è la stampa in microcontatto.
Prima dell'inizio del protocollo, la stampa di microcontatti sul substrato utilizza un florescent per etichettare la proteina per verificare visivamente la stampa finale sul modello. Iniziare mescolando vigorosamente l'elastomero di base PDMS e gli agenti polimerizzanti con una punta di pipetta fino a quando le bolle non vengono disperse in modo omogeneo all'interno della miscela. Quindi rimuovere le bolle con essiccazione sottovuoto.
Posizionare una goccia della miscela PDMS essiccata su un coverslip quadrato o circolare e ruotare il coverslip su un rivestimento di spin a 2.500 giri/min per 30 secondi. Incubare il coverslip in un forno a 60 gradi Celsius, per una o due ore, o a temperatura ambiente durante la notte. Per preparare un substrato micro modellato, posizionare un wafer di silicio modellato all'interno di una piastra di Petri circolare di 150 millimetri di diametro per 15 millimetri di altezza e versare il PDMS de-gassato sul wafer.
Solidificato il PDMS in un forno a 60 gradi Celsius durante la notte. Lasciare raffreddare il PDMS a temperatura ambiente. Quindi utilizzare un bisturi chirurgico per tagliare francobolli di 30 per 30 millimetri quadrati contenenti i modelli corretti facendo attenzione a non danneggiare il wafer di silicio.
Sterilizzare i timbri PDMS e i foglietti di copertura sintonizzabili immergendoli in 70%etanolo per 30 minuti. Per confermare l'efficacia del micropattern, asciugare la superficie dei timbri PDMS utilizzando un flusso d'aria filtrato e pipettare 15 microgrammi per millilitro soluzione BSA per coprire l'intero lato modellato del timbro. Incubare i timbri con la soluzione BSA per un'ora a temperatura ambiente per consentire l'adsorbimento proteico, quindi asciugare ad aria i francobolli per rimuovere la soluzione BSA.
Utilizzare il flusso d'aria filtrato per asciugare la superficie dei coperchi sintonizzabili. Portare il lato modellato del timbro in contatto conforme con il coverslip sintonizzabile per consentire l'adsorbimento BSA sulla superficie del coverslip e premere delicatamente il timbro contro il coperchio per cinque minuti. Esaminate il micropattern utilizzando un microscopio a fluorescenza con un filtro FITC.
Per stampare le aree adesive delle celle piuttosto che i motivi fluorescenti sostituire la laminina con la proteina BSA. Rimuovere i timbri dai foglietti di copertura e trasferire i coperchi in una piastra sterilizzata a sei pozza. Aggiungere due millilitri di soluzione 0,2%Pluronic F-127 in ogni pozzo per coprire la superficie dello slittamento del coperchio e incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente.
Aspirare la soluzione F-127 e lavare il coperchio scivola cinque volte con PBS, una volta con il mezzo di coltura cellulare, quindi seminare le cellule di Schwann a una densità di semina di 1000 cellule per centimetro al quadrato. 45 minuti dopo la semina cellulare, rimuovere il mezzo di coltura cellulare e lavare il coperchio scivola due volte con PBS per evitare che più cellule aderiscano allo stesso modello. Mantenere le cellule nell'ambiente di coltura cellulare desiderato per 48 ore prima della quantificazione.
Per creare substrati di coltura cellulare a motivi di linea per l'esame delle celle allineate, creare i timbri in base alle indicazioni del manoscritto e tagliarli alle dimensioni desiderate. Preparare due piastre di Petri rivestite con una superficie PDMS sintonizzabile come descritto in precedenza ed eseguire la stampa di microcontatti per stampare aree adesive a celle a motivi di linea su uno dei piatti. Dopo aver rimosso i timbri, riempire la piastra di Petri con quattro millilitri di soluzione 0,2%Pluronic F-127 e incubarla per un'ora.
Risciacquare ogni lato del timbro PDMS tre volte con il 70% di etanolo e asciugarlo con aria. Ruotare i timbri PDMS e stampare l'area adesiva della cella non serie sulla seconda piastra di Petri come descritto in precedenza. Dopo aver incubato i piatti con la soluzione F-127, rimuovere la soluzione e lavare i piatti tre volte con PBS e una volta con mezzo di coltura cellulare fresco.
Quindi seminare le cellule sui piatti e mantenerle alle condizioni desiderate per 48 ore prima di preparare i lisati. Per preparare i lisati, lavare le celle con PBS ghiacciato per due minuti, quindi aggiungere 80 microlitri di soluzione RIPA, preparati secondo le indicazioni del manoscritto, su ogni area adesiva cellulare e incubare le cellule su un blocco di ghiaccio per 25 minuti. Raschiare le cellule di Schwann con il raschietto per celle per cinque minuti e raccogliere il lisato in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri etichettato.
Centrifugare il lysate per 15 minuti a 12 mila volte G e quattro gradi Celsius. Raccogliere il supernatante e trasferirlo in un tubo di microcentrifugo pulito. I substrati rivestiti di laminina hanno portato a un tasso di proliferazione più elevato rispetto ai substrati rivestiti di collagene e fibronectina.
Le cellule di Schwann su substrati con rivestimento laminino e moduli diversi hanno mostrato che substrati relativamente più morbidi hanno diminuito i tassi di proliferazione cellulare. Le cellule sono state anche analizzate per l'espressione proteica. L'espressione del fattore trascrizionale c-Jun è stata upregolata man mano che i substrati diventavano più morbidi.
Tuttavia, è stato significativamente deregolamentato sui substrati più morbidi. Sui substrati rigidi, i substrati rivestiti di collagene hanno portato alla più alta espressione c-Jun, poiché i substrati sono diventati più morbidi, la laminina ha mostrato i più alti livelli di c-Jun. Le cellule sono state poi macchiate di rhodamine-phalloidin per esplorare il ruolo della diffusione cellulare e dell'area nell'espressione c-Jun.
Quando sono state create linee adesive cellulari sui substrati di coltura cellulare, le proporzioni nucleari delle cellule sementi sul substrato del modello sono aumentate rispetto a quella delle cellule su substrati non modellati. L'espressione del recettore della neurotrofina c-Jun e p75 è stata upregolata in cellule dense con un'area di diffusione più piccola. Le celle con pattern di linea hanno anche portato a un'espressione più elevata di NTR c-Jun e p75 rispetto alle celle non modellate.
Le geometrie adesive a celle stampate in microcontatto sono state create per controllare con precisione l'area di diffusione e l'allungamento delle cellule eliminando al contempo le interazioni tra cellule e cellule. L'aumento delle proporzioni cellulari ha causato un aumento dell'allungamento nucleare. L'espressione di c-Jun era upregolata sia dall'allungamento cellulare che dall'inibizione della diffusione cellulare.
La colorazione dell'immunofluorescenza sia per i nuclei che per l'actina ha confermato che l'area di diffusione cellulare e l'allungamento sono stati controllati con precisione attraverso questo metodo di micropatterning. Questa tecnica ha spianato la strada all'utilizzo dei nostri substrati tonni come metodo per analizzare meccanicamente la biologia cellulare di Schwann e la segnalazione nel contesto della rigenerazione e del cancro.
