Questo metodo è utile per analizzare il ruolo di alcune molecole nella guida assonale e nella migrazione neuronale durante lo sviluppo del neuro sistema. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'analisi dei risultati è rapida e semplice e non richiede software complesso che implicherebbe molta formazione per i ricercatori. A dimostrare la procedura sarà Mirian Segura-Feliu, un tecnico del nostro laboratorio e me stesso.
Per iniziare la piastra 200,000 cellule COS-1 in 35 millimetri piastre di Petri e incubare con mezzo di coltura completo in un incubatore di coltura cellulare al fine di leggere la confluenza dal 70 all'80% durante la notte. Il giorno seguente, per trasfetto le cellule COS-1 con il DNA che codifica per la molecola candidata usando il metodo di trasfezione a base di liposoma. Mescolare prima 250 microlitri di mezzo privo di siero e da uno a 2 microgrammi di DNA in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Per preparare un tubo liposomiale, aggiungere 240 microlitri del mezzo privo di siero e 10 microlitri di reagente di trasfezione liposomiale e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere il contenuto del tubo del DNA al tubo lipsomico. Mescolare e incubare delicatamente a temperatura ambiente per 15 minuti.
Sostituire il mezzo sulle cellule coltivate con 1,5 millilitri del mezzo privo di siero. Aggiungere lentamente la miscela di liposomi del DNA e cadere saggiamente alle cellule. Incubare nell'incubatore di coltura cellulare di anidride carbonica per tre ore.
Dopo aver completato l'incubazione, sostituire il mezzo con il mezzo di coltura completo e incubare durante la notte nell'incubatore. Il giorno seguente sciacquare le cellule con pbs molare 0,1 dulbecco. Aggiungere 800 microlitri tripside EDTA per ogni piatto e incubare per cinque o 15 minuti nell'incubatore di anidride carbonica.
Raccogliere celle staccate con due millilitri di mezzo di coltura completo in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e aggiungere 10 millilitri dello stesso mezzo. Centrifugare le cellule a quattro gradi Celsius a 130 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e conservare il pellet contenente cellule COS-1 sul ghiaccio.
Dopo aver preparato la miscela di lavorazione del collagene, aggiungere da 100 a 150 microlitri della miscela di collagene al pellet delle cellule trasfette e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Stendere da 45 a 50 microlitri di miscela di pellet di cellule di collagene su una piastra di Petri di 35 millimetri per formare una banda uniforme di cellule di collagene, lunga approssimativamente da uno a 1,5 centimetri. Posizionare il piatto nell'incubatrice a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando non si osserva la gelazione.
Preparare una seconda striscia contenente celle di controllo in un secondo piatto di coltura e posizionarla nell'incubatrice. Al termine della gelazione, aggiungere da tre a quattro millilitri di 37 gradi celsius warmed COS-1 mezzo di coltura completo per ogni piatto contenente le strisce di cellule di collagene gelate e metterli nell'incubatrice. Utilizzare un bisturi fine o un elicottero tissutale per tagliare le strisce cellulari di collagene per generare piccoli pezzi quadrati, lunghi da 400 a 500 micrometri.
Trasferire tutte le sezioni dalla stessa condizione di trasfezione a una piastra di Petri contenente da tre a 3,5 millilitri di mezzi di coltura neuronali. Controllare al microscopio sezionato la qualità dei pezzi e posizionare i piatti nell'incubatrice. Usa le forbici per tagliare le corna embrionali il giorno embrionale 16.5 dalla cavità addominale di un ratto femmina incinta sacrificato e posizionarle in una grande piastra di Petri contenente tampone freddo HBSSg.
Mettere il piatto nel cappuccio di flusso laminare e utilizzare le forcette dritte per estrarre gli embrioni e metterli in un nuovo piatto contenente HBBSg freddo. Con piccole forcette, rimuovere la pelle, quindi con forcette curve e dritte, sezionare attentamente il cervello e posizionare in un piatto contenente HBSSg freddo. Al microscopio sezionato, usando un bisturi o forbici fini, tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana per separare entrambi gli emisferi.
Quindi, rimuovere il diencefalo e con forcette fini, rimuovere le meningi e i vasi sanguigni dai pezzi cerebrali. Utilizzare 100%etanolo per pulire tutte le parti dell'elicottero tissutale, in particolare la piastra di taglio PTFE e la lama del rasoio e mantenere l'elicottero del tessuto nella cappa di flusso laminare sotto l'illuminazione UV per 15 minuti. Trasferire ogni pezzo di tessuto sulla piastra di taglio dell'elicottero tissutale.
Dopo che il tessuto è stato tritato, trasferire i pezzi dalle piastre di Petri da 35 millimetri riempite con da tre a quattro millilitri di NCM completo. Utilizzando aghi di tungsteno fini, finire la dissezione tissutale in NCM completo. Controllare la qualità delle fette ottenute al microscopio di sezionazione, assicurandosi che gli strati siano chiaramente identificabili nell'ottica del campo scuro e sezionare la regione di interesse con aghi di tungsteno.
Conservare i pezzi di buona qualità in un mezzo NCM completo nell'incubatore di anidride carbonica. La dimostrazione visiva è fondamentale nei passaggi relativi alla preparazione delle co-culture che facilitano le parole per comprendere il processo. Posizionare diverse piastre sterili di coltura del pozzo nel cappuccio del flusso laminare e preparare una miscela di lavoro di collagene come in precedenza.
Aggiungere da 15 a 20 microlitri della miscela di idrogel nel fondo di ogni pozzo per produrre una base di collagene circolare. Posizionare i piatti nell'incubatrice fino a quando non si osserva una gelazione completa. E controlla la qualità del collagene gelato.
Con una pipetta, trasferire un piccolo pezzo di aggregato cellulare COS-1 sulla base idrogel, quindi utilizzare una pipetta per posizionare un pezzo di tessuto sulla stessa base, vicino al pezzo di cellule aggregato a una distanza di una dimensione di espianto. Dopo aver preparato una nuova miscela di collagene funzionante sul ghiaccio, pipettare delicatamente da 15 a 20 microlitri di questa nuova miscela per coprire l'espianto e l'aggregato cellulare, facendo un panino come la coltura di idrogel. Utilizzare un ago di tungsteno fine per riorientare l'espianto in modo che affronti l'aggregato cellulare a 500-600 micrometri.
Restituire la piastra all'incubatrice fino a quando non si osserva la gelazione e quindi aggiungere 0,5 millilitri di NCM completo integrato con integratore 2%B27 e mantenere le colture per 36-48 ore nell'incubatore. Quando gli assoni ippocampali si confrontarono con Netrin-1, crebbero preferenzialmente verso la fonte di Netrin-1, indicando che Netrin-1 agisce come una molecola chemio attraente per questi assoni. Nella condizione di controllo, o trasfezione fittizia, tutti gli assoni crescevano radialmente, senza alcuna preferenza direzionale.
Quando gli assoni ippocampali si confrontarono con le cellule secernenti Sema3E, la maggior parte di esse cresceva di fronte all'aggregato cellulare, indicando che Sema3E agisce come una molecola chemio repulsiva per questi assoni. Questa rappresentazione schematica del metodo di risposta e quantificazione assionale mostra che in condizioni di controllo, gli assoni erano equamente distribuiti sia nei quadranti prossimali che distale, mostrati con crescita radiale. Ciò indicava un rapporto distale prossimale o PD di uno.
Quando gli espianto mostravano un aumento del numero di assoni nel quadrante prossimale rispetto al distale, indicando l'attrazione chemio, il rapporto PD era maggiore di uno. Quando il numero di assoni era più alto nel quadrante distale che in quello prossimale, indicando la repulsione della chemio, il rapporto PD era inferiore a uno. Seguendo questo metodo, i ricercatori possono ottenere informazioni essenziali sul ruolo di alcune molecole durante lo sviluppo neuronale, che ci consente di stabilire un punto di partenza per esplorare ulteriormente le funzioni.
Sebbene questa tecnica sia utile nello sviluppo neuronale così com'è, potrebbe anche essere applicata nello screening farmacologico, nell'angiogenesi e nell'ingegneria tissutale come strategie.
