Vorremmo ringraziare Bruker per il loro sostegno. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Monash University Advancing Women's Success Grant (K. Kochan). A.Y.P riconosce il sostegno di una borsa di studio del National Health and Medical Research Council Practitioner Fellowship (APP1117940). Questo lavoro è stato finanziato da un Australian Research Council Discovery Project DP180103484. Vorremmo ringraziare il signor Finlay Shanks per il suo supporto strumentale e la signora Xenia Kostoulias per la sua assistenza tecnica con i campioni.

Tutti i lavori condotti con batteri patogeni devono essere intrapresi con adeguate misure di sicurezza. Questi includono il lavoro in un laboratorio con un adeguato livello di biosicurezza e in una cabina di biosicurezza (PC2), nonché un'attenta decontaminazione dell'area di lavoro con un disinfettante appropriato, ad esempio una soluzione di etanolo all'80%. I DPI appropriati devono essere indossati tutto il tempo.
1. Preparazione di solventi e materiali
<ol><li>Solventi: utilizzare acqua ultrapura come solvente. Utilizzare acqua purificata, autoclavata prima dell'esperimento per evitare qualsiasi potenziale contaminazione incrociata.</li>
	<li>Substrato: utilizzare uno di questi substrati per AFM-IR, ad esempio ZnSe, CaF2,BaF2,ecc. Poiché AFM-IR è, in linea di principio, una tecnica non distruttiva, è possibile applicare una varietà di altri strumenti di ricerca allo stesso campione dopo l'analisi AFM-IR. Ad esempio, la correlazione dei risultati con la spettroscopia Raman può essere eseguita se vengono utilizzati vetrini CaF2 o BaF2 di grado Raman.</li>
	<li>Utilizzare flaconcini di vetro invece di tubi di plastica poiché la plastica può contaminare il campione.</li>
</ol>2. Preparazione del campione per AFM-IR
<ol><li>Crescita/incubazione del campione<ol>
<li>Coltiva i batteri in mezzi liquidi o su piastre solide. Selezionare il tipo di mezzo, le condizioni di crescita (ad esempio, temperatura, disponibilità di ossigeno) e il tempo di crescita in base alle esigenze specifiche delle specie di batteri in esame. Ad esempio, per S. aureus Heart Infusion (HI) possono essere utilizzate piastre di agar, con crescita per 16 ore a 37 °C in condizioni aerobiche. NOTA: Per ottenere i migliori risultati, la crescita / incubazione dovrebbe produrre abbastanza batteri che consentirebbero la raccolta di un micro-pellet di campione. Il numero specifico di unità formanti colonie o cellule batteriche dipende dal tipo e dalle dimensioni del batterio.</li>
	</ol></li>
	<li>Deposizione del campione<ol>
<li>Usando un anello sterile, raccogli con cura i batteri dalle colonie sulla piastra di agar e trasferiscili in un tubo di vetro. Raccogli i batteri solo dalla parte superiore delle colonie. Se si raccolgono campioni da una coltura liquida, utilizzando una pipetta, trasferire circa 1 mL della sospensione batterica in un tubo di vetro. Il volume può essere modificato a seconda della carica batterica. NOTA: è importante cercare di non raccogliere (o minimizzare il più possibile la raccolta di) qualsiasi mezzo da sotto la colonia. Le fasi successive della preparazione del campione mirano a rimuovere qualsiasi potenziale residuo di supporto. La minimizzazione del potenziale mezzo residuo fin dall'inizio consente l'acquisizione spettrale di dati da cellule batteriche purificate. I passaggi 2.2.2 e 2.2.3 si applicano ai campioni preparati da piastre di agar. Per i campioni preparati a partire da mezzi liquidi, passare al punto 2.2.4.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di acqua ultrapura al tubo. Vortice fino a quando il pellet batterico raccolto non è più visibile sul fondo del tubo (in genere 1-2 min).</li>
		<li>Stimare la torbidità approssimativa della soluzione utilizzando, ad esempio, gli standard McFarland mediante confronto visivo30 tra la soluzione preparata e gli standard McFarland. Se la torbidità della sospensione batterica sembra essere molto bassa, aggiungere più batteri dalla piastra usando un anello sterile e un vortice di nuovo. Ripetere fino a quando la torbidità approssimativa della soluzione è paragonabile agli standard McFarland 0,5 e 1. Questo generalmente produrrà una buona quantità di pellet batterico.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione batterica a 3.000 x g per 5 min per ottenere un pellet. NOTA: I parametri di centrifugazione possono essere modificati per ottenere pellet batterico. Si deve prestare attenzione se si aumenta la forza g, per non indurre la rottura dei batteri (specialmente in caso di batteri Gram-negativi).</li>
		<li>Utilizzando una pipetta, rimuovere delicatamente il surnatante da sopra il pellet. Aggiungere 1 mL di acqua ultrapura al tubo e vortice per sospendere nuovamente il pellet. Successivamente, centrifugare il campione come è stato fatto nel passaggio 2.2.4.</li>
		<li>Ripetere la procedura di lavaggio (passaggi 2.2.2 e 2.2.4) almeno tre volte. In caso di prelievo del campione iniziale da mezzi liquidi, ripetere la procedura almeno quattro volte (rimozione del supporto seguita da tre lavaggi).</li>
		<li>Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante, aggiungere acqua ultrapura e vortice per almeno 2 minuti. Successivamente, depositare 5 μL del campione sul substrato (ad esempio, grado Raman CaF2).</li>
		<li>Se lo spessore desiderato del campione è un multistrato di batteri, lasciare asciugare il campione all'aria.</li>
		<li>Se lo spessore desiderato è monostrato o singoli batteri, subito dopo aver depositato il campione (punto 2.2.7) aggiungere tra 20-100 μL di acqua ultrapura e mescolare delicatamente con una punta di pipetta. Lasciare asciugare all'aria. NOTA: Il volume esatto di acqua può variare tra gli esperimenti in quanto dipende da molti fattori (ad esempio, dimensioni dell'organismo, densità del pellet, ecc.) ed è, quindi, meglio determinato empiricamente. La preparazione di una serie di campioni con volumi variabili di acqua ultrapura aggiunta consente di selezionare un campione con lo spessore / densità desiderata di batteri. Lo spessore/densità dei batteri può essere facilmente visualizzato tramite AFM nelle fasi successive. Esempi di immagini AFM da campioni monostrato e a cella singola sono mostrati nella Figura 1A–H.</li>
		<li>Montare il substrato su un disco campione metallico AFM utilizzando nastro biadesivo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparazione dello strumento
NOTA: Le procedure strumentali qui descritte sono per lo strumento elencato nella Tabella dei Materiali. La procedura strumentale di dettaglio può differire leggermente da quella qui descritta se si utilizza un modello più recente dello strumento AFM-IR.
<ol><li>Accendere e inizializzare lo strumento premendo il pulsante Inizializza. Assicurarsi che l'otturatore laser sia in posizione aperta per il test laser.</li>
	<li>Se è impostato un sistema di spurgo, spurgare lo strumento con N2 attivando il flusso di N2. Regolare lo spurgo dell'azoto per ottenere un livello di umidità stabile (ad esempio, il 20%). Assicurarsi che l'umidità non fluttui durante le misurazioni e tra la raccolta dei dati di fondo e del campione. Si consiglia di consentire circa 20 minuti per stabilizzare i livelli di umidità.</li>
	<li>Caricare il campione nella camera del campione premendo il pulsante Carica. Il caricamento dei campioni viene eseguito tramite la procedura guidata del software. Durante il funzionamento della procedura guidata del software, concentrarsi prima sulla punta, utilizzando le frecce per spostare lo stadio del microscopio nella direzione Z e fare clic su Avanti. In secondo luogo, regolare il punto di raccolta dei dati, utilizzando frecce che guidano il movimento in piano e allineare il laser AFM e il rilevatore AFM utilizzando le manopole sulla parte superiore della testa AFM. Successivamente, concentrarsi sulla superficie del campione spostando lo stadio del microscopio in direzione Z. NOTA: illustrazioni dettagliate di ogni fase del caricamento del campione sono fornite nel manuale del software31. Concentrarsi sul campione dovrebbe essere condotto con cura. Quando ci si avvicina alla superficie del campione nella direzione Z, utilizzare una velocità del motore lenta.</li>
	<li>Avvicinati all'esempio senza impegnarti facendo clic sul pulsante Approccio.</li>
</ol>4. Raccolta dei dati
<ol><li>Sfondo<ol>
<li>Prima dell'acquisizione dei dati, raccogliere lo sfondo. Per la raccolta dello sfondo, assicurarsi che l'otturatore laser sia in posizione Aperta. Selezionare l'intervallo spettrale e la risoluzione (a seconda dello scopo dell'analisi) e il numero di scansioni e il numero di co-medie di sfondo. Questi sono generalmente raccomandati per essere alti (ad esempio, 1024 scansioni e 3 co-medie). NOTA: In generale, si raccomanda una risoluzione spettrale di 4 cm-1 o 8 cm-1 e intervalli spettrali di 3.200 cm-1-2.800 cm-1 e 1.800 cm-1-900 cm-1.</li>
		<li>Dopo l'acquisizione dello sfondo, salvare il file di sfondo. Il file non viene memorizzato automaticamente. Modificate la posizione dell'otturatore laser su Chiudi .</li>
	</ol></li>
	<li>Campione – spettri singoli<ol><li>Premere il pulsante Attiva per interagire con l'esempio. Il sistema inizierà ad avvicinarsi alla superficie del campione, fino a quando non viene rilevato il contatto diretto. NOTA: il set point utilizzato in questo lavoro variava tra 0,15-2 V e i guadagni di feedback (I Gain e P Gain) erano in genere impostati su 3 e 10. Le sonde a contatto NIR2 sono comunemente utilizzate con il sistema nanoIR2 (modello: PR-EX-nIR2-10, frequenza di risonanza (kHz): 13 +/−4 kHz, costante di molla (N/m): 0,07−0,4 Nm-1).</li>
		<li>Raccogliete un'immagine AFM per visualizzare la superficie. In primo luogo, eseguire la scansione di un'area più ampia (ad esempio, 50 x 50 μm) con una risoluzione spaziale inferiore (ad esempio, 200 x 200 punti) (Figura 1I). NOTA: i dati AFM-IR vengono sempre raccolti in modalità contatto, tuttavia, i dati AFM possono essere raccolti in modalità contatto o tocco.</li>
		<li>Dall'immagine di altezza/deflessione AFM, selezionare un'area specifica di interesse e ri-immaginerla con una risoluzione spaziale più elevata (Figura 1J–K). Assicurarsi che la velocità di raccolta dei dati sia appropriata, con un movimento lento della punta (ad esempio, velocità di scansione 0,2-0,4 Hz).</li>
		<li>Selezionare il punto di misurazione (ad esempio, singolo batterio) e spostare la punta sul punto.</li>
		<li>Allineare il laser IR. A tale scopo, utilizzare un numero d'onda in cui il campione assorbirà. Per i materiali biologici questo può essere, ad esempio, ammide I (1655 cm-1). Assicurarsi che il filtro passa banda sia disattivato e fare clic su Avvia IR. Il grafico a destra nel nanoIRmetro (FFT della deflessione visualizzata come ampiezza vs frequenza) dovrebbe mostrare almeno un picco chiaro e il grafico a sinistra (deflessione vs tempo) dovrebbe avere una forma d'onda periodica. In caso contrario, procedere all'ottimizzazione dei punti IR. NOTA: anche se la trasformata di Fourier veloce (FFT) e la deflessione mostrano un profilo previsto, si consiglia di eseguire l'ottimizzazione degli spot IR per almeno diversi numeri d'onda, in cui sono previste bande.</li>
		<li>Ottimizzare gli hot spot per la raccolta dei dati IR utilizzando i valori del numero d'onda selezionati. Può essere utile utilizzare uno spettro IR convenzionale dei batteri (ad esempio, spettro ATR del pellet batterico) per identificare le posizioni delle bande e utilizzarle per ottimizzare i punti caldi. Selezionare vari valori di numero d'onda (ad esempio, 8-10) da varie regioni spettrali. NOTA: Se lo spettro IR convenzionale dei batteri di interesse non può essere raccolto prima della raccolta dei dati AFM-IR, gli spettri batterici disponibili in letteratura possono essere utilizzati come guida approssimativa. Il risultato dell'ottimizzazione di uno spot IR è un'immagine, che presenta una mappa del segnale di magnitudo FFT in ogni posizione x e y. La posizione con il segnale più grande viene selezionata automaticamente. Esempi di tali immagini sono forniti nel manuale del software31.</li>
		<li>Dopo aver ottimizzato gli spot IR per i valori del numero d'onda selezionati, definire i parametri di raccolta dei dati spettrali: regione spettrale, risoluzione spettrale, numero di scansioni e potenza applicata e inserirli nelle finestre appropriate del software. La risoluzione spettrale deve corrispondere alla risoluzione di fondo e la regione spettrale deve trovarsi all'interno della regione spettrale per la quale è stato raccolto lo sfondo. NOTA: Un set iniziale generico di parametri potrebbe essere: intervallo spettrale: 3200 cm-1-2800 cm-1 e 1800 cm-1-900 cm-1, risoluzione spettrale: 4 cm-1 o 8 cm-1, numero di scansioni: 512-2048.</li>
		<li>Se necessario, regolare la potenza del laser in base al segnale. In generale, valori compresi tra l'8% e il 10% della potenza del laser dovrebbero essere sufficienti per una buona qualità del segnale. Valori più elevati possono essere utilizzati con cautela, in quanto possono causare danni al campione. NOTA: la potenza percentuale del laser può variare a seconda del tipo di laser IR. I valori percentuali indicati qui sono per il laser OPO.</li>
		<li>Fare clic su Acquisisci per raccogliere lo spettro AFM-IR.</li>
		<li>Raccogliere nuovamente i dati AFM dalla stessa area dopo la raccolta dello spettro AFM-IR. Questo è altamente raccomandato in quanto rivelerà qualsiasi potenziale deriva e / o influenza distruttiva sul campione.</li>
		<li>Se lo spettro AFM-IR è soddisfacente e non si osserva alcuna influenza distruttiva sul campione, procedere con la raccolta dei dati. Se necessario, definite una serie di punti per la raccolta dei dati utilizzando l'opzione Array e l'immagine di altezza o deflessione AFM raccolta. Questa opzione permette di raccogliere spettri consecutivamente da ogni punto con gli stessi parametri spettrali definiti per un singolo spettro.</li>
		<li>Se l'immagine AFM raccolta dopo la raccolta dello spettro AFM-IR rivela un'influenza distruttiva sul campione (tipicamente un punto bruciato), ridurre la potenza; selezionate un punto diverso e ripetete i passaggi da 4.3.8 a 4.3.11.</li>
		<li>Se il segnale nello spettro AFM-IR non è soddisfacente, verificare la correttezza dell'ottimizzazione degli spot IR (passo 4.3.6). Se è corretto, aumentare leggermente la potenza del laser e ripetere i passaggi 4.3.7–4.3.11. Questo può essere ripetuto fino a raggiungere un segnale soddisfacente.</li>
	</ol></li>
	<li>Esempio – approccio di imaging NOTA: si consiglia vivamente di registrare un singolo spettro AFM-IR del batterio prima di raccogliere un'immagine di distribuzione dell'intensità per un valore di numero d'onda selezionato.<ol>
<li>Registrare un'immagine AFM dell'area campione scelta. Per fare ciò, prima raccogli l'immagine AFM di un'area più ampia con una risoluzione spaziale inferiore (ad esempio, 50 x 50 μm, 200 x 200 punti), quindi seleziona una regione di interesse e raccogli un'immagine AFM con una risoluzione spaziale aumentata (come illustrato nella Figura 1I-K).</li>
		<li>Selezionare i valori del numero d'onda per l'imaging AFM-IR.</li>
		<li>Assicurarsi che lo spot IR del laser sia ottimizzato per i valori del numero d'onda selezionato (passaggio 4.3.6). Se lo spot IR non è ottimizzato per alcuni numeri d'onda (nessun massimo chiaro), ottimizzarlo per loro.</li>
		<li>Definire i parametri dell'area definita: la larghezza e l'altezza, il numero di punti dati in direzione X e Y. NOTA: se viene applicata la selezione consecutiva di punti dalle immagini AFM precedenti (come illustrato nella Figura 1I-K),i campi di larghezza e altezza verranno riempiti automaticamente, al momento della marcatura dell'area.</li>
		<li>Definire i parametri di acquisizione del segnale spettrale: la lunghezza d'onda, il numero di scansioni e la potenza del laser. NOTA: il numero di scansioni deve essere mantenuto entro limiti ragionevoli. 64 o 32 scansioni in genere consentono una quantità sufficiente di segnale.</li>
		<li>Definite i parametri del movimento della punta AFM facendo clic su Scan Rate. Maggiore è il numero di scansioni nel passaggio precedente e il numero di punti dati in direzione X, più lenti dovranno essere i movimenti della punta. La mancanza di regolazione tra questi parametri comporterà un movimento troppo veloce della punta, impedendo l'effettiva acquisizione di un numero definito di scansioni da ciascun punto. NOTA: ad esempio, per una raccolta appropriata di segnale IR con 64 co-aggiunte e 200 punti, impostare la velocità di scansione su 0,07 kHz.</li>
		<li>Assicurarsi che la casella Abilita imaging IR sia selezionata.</li>
		<li>Inizia l'imaging. AFM-IR dell'intensità del segnale al numero d'onda selezionato sarà raccolto contemporaneamente ai dati AFM da quell'area. NOTA: Quando si utilizza il laser OPO, è possibile raccogliere contemporaneamente l'immagine della frequenza di picco di risonanza del contatto. Questo può essere utilizzato per ottenere informazioni sulla rigidità relativa del campione in diverse posizioni.</li>
		<li>Utilizzare la finestra Sequenza di acquisizione per impostare una raccolta consecutiva di dati AFM-IR dalla stessa area con gli stessi parametri, ma per valori di numero d'onda diversi. Per fare ciò, apri la finestra Sequenza di acquisizione, digita ogni numero d'onda e definisci la potenza laser applicata (per ogni numero d'onda).</li>
		<li>Esportare i dati raccolti (AFM e AFM-IR, spettri singoli e imaging) in vari formati e analizzarli utilizzando metodi adeguati a specifici scopi di ricerca.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Sears, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+partnership:+celebrating+our+gut+flora.">A dynamic partnership: celebrating our gut flora.</a> Anaerobe. 11 (5), 247-251 (2005).</li><li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+sepsis+incidence+and+mortality,+1990-2017:+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li><li>Seymour, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+treatment+and+mortality+during+mandated+emergency+care+for+sepsis.">Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (23), 2235-2244 (2017).</li><li>Weiss, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+antimicrobial+therapy+increases+mortality+and+organ+dysfunction+duration+in+pediatric+sepsis.">Delayed antimicrobial therapy increases mortality and organ dysfunction duration in pediatric sepsis.</a> Critical Care Medicine. 42 (11), 2409-2417 (2014).</li><li>Peker, N., Couto, N., Sinha, B., Rossen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+bloodstream+infections+from+positive+blood+cultures+and+directly+from+blood+samples:+recent+developments+in+molecular+approaches.">Diagnosis of bloodstream infections from positive blood cultures and directly from blood samples: recent developments in molecular approaches.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 24 (9), 944-955 (2018).</li><li>Aminov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+antibiotics+and+antibiotic+resistance+in+nature.">The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature.</a> Environmental Microbiology. 11 (12), 2970-2988 (2009).</li><li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+resistance+worldwide:+causes,+challenges+and+responses.">Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses.</a> Nature Medicine. 10 (12), 122-129 (2004).</li><li>Roca, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+threat+of+antimicrobial+resistance:+science+for+intervention.">The global threat of antimicrobial resistance: science for intervention.</a> New Microbes and New Infections. 6, 22-29 (2015).</li><li>O'Neill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+review+on+antimicrobial+resistance.+Tackling+drug-resistant+infections+globally:+final+report+and+recommendations.">The review on antimicrobial resistance. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations.</a> Wellcome Trust. , (2016).</li><li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistome:+what's+new.">The antibiotic resistome: what's new.</a> Current Opinion in Microbiology. 21, 45-50 (2014).</li><li>Piddock, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assess+drug-resistance+phenotypes,+not+just+genotypes.">Assess drug-resistance phenotypes, not just genotypes.</a> Nature Microbiology. 1 (8), 16120 (2016).</li><li>Naumann, D., Helm, D., Labischinski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+characterizations+by+FT-IR+spectroscopy.">Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy.</a> Nature. 351 (6321), 81-82 (1991).</li><li>Zarnowiec, P., Lechowicz, L., Czerwonka, G., Kaca, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourier+Transform+Infrared+Spectroscopy+(FTIR)+as+a+tool+for+the+identification+and+differentiation+of+pathogenic+bacteria.">Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) as a tool for the identification and differentiation of pathogenic bacteria.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (14), 1710-1718 (2015).</li><li>Quintelas, C., Ferreira, E. C., Lopes, J. A., Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+evolution+of+infrared+spectroscopy+applied+to+bacterial+typing.">An overview of the evolution of infrared spectroscopy applied to bacterial typing.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700449 (2018).</li><li>San-Blas, E., Cubill&#225;n, N., Guerra, M., Portillo, E., Esteves, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+xenorhabdus+and+photorhabdus+bacteria+by+Fourier+transform+mid-infrared+spectroscopy+with+attenuated+total+reflection+(FT-IR/ATR).">Characterization of xenorhabdus and photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR).</a> Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 93, 58-62 (2012).</li><li>Sousa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+the+acinetobacter+calcoaceticus-acinetobacter+baumannii+complex+species+by+Fourier+transform+infrared+spectroscopy.">Discrimination of the acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex species by Fourier transform infrared spectroscopy.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 33 (8), 1345-1353 (2014).</li><li>Rodriguez-Saona, L. E., Khambaty, F. M., Fry, F. S., Calvey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+identification+of+bacterial+strains+by+Fourier+transform+near-infrared+spectroscopy.">Rapid detection and identification of bacterial strains by Fourier transform near-infrared spectroscopy.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49 (2), 574-579 (2001).</li><li>Dawson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+Fourier+transform+infrared+spectroscopy+for+the+rapid+typing+of+uropathogenic+Escherichia+coli.">Implementation of Fourier transform infrared spectroscopy for the rapid typing of uropathogenic Escherichia coli.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 33 (6), 983-988 (2014).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Antimicrobial+Resistance-Related+Changes+in+Biochemical+Composition+of+Staphylococcus+aureus+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy-Infrared+Spectroscopy.">Detection of Antimicrobial Resistance-Related Changes in Biochemical Composition of Staphylococcus aureus by Means of Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15397-15403 (2019).</li><li>Dazzi, A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-IR:+Technology+and+Applications+in+Nanoscale+Infrared+Spectroscopy+and+Chemical+Imaging.">AFM-IR: Technology and Applications in Nanoscale Infrared Spectroscopy and Chemical Imaging.</a> Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).</li><li>Dazzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-IR:+combining+atomic+force+microscopy+and+infrared+spectroscopy+for+nanoscale+chemical+characterization.">AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization.</a> Applied Spectroscopy. 66 (12), 1365-1384 (2012).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 15 (140), (2018).</li><li>Katzenmeyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-infrared+spectroscopy+beyond+the+diffraction+limit+via+direct+measurement+of+the+photothermal+effect.">Mid-infrared spectroscopy beyond the diffraction limit via direct measurement of the photothermal effect.</a> Nanoscale. 7 (42), 17637-17641 (2015).</li><li>. Bruker Life Science Applications Available from: <a target="_blank" href="https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html">https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html</a> (2020)</li><li>Mayet, C., Dazzi, A., Prazeres, R., Ortega, J. M., Jaillard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+and+imaging+of+bacterial+polymer+nanogranules+by+infrared+nanospectroscopy.">In situ identification and imaging of bacterial polymer nanogranules by infrared nanospectroscopy.</a> Analyst. 135 (10), 2540-2545 (2010).</li><li>Baldassarre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+amide+I+absorption+in+single+bacteria+and+mammalian+cells+with+resonant+infrared+nanospectroscopy.">Mapping the amide I absorption in single bacteria and mammalian cells with resonant infrared nanospectroscopy.</a> Nanotechnology. 27 (7), 075101 (2016).</li><li>Vitry, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+infrared+and+mode+synthesizing+atomic+force+microscopy:+Application+to+the+study+of+lipid+vesicles+inside+Streptomyces+bacteria.">Combining infrared and mode synthesizing atomic force microscopy: Application to the study of lipid vesicles inside Streptomyces bacteria.</a> Nano Research. 9 (6), 1674-1681 (2016).</li><li>Dazzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+mapping+of+the+distribution+of+viruses+into+infected+bacteria+with+a+photothermal+method.">Chemical mapping of the distribution of viruses into infected bacteria with a photothermal method.</a> Ultramicroscopy. 108 (7), 635-641 (2008).</li><li>Steenbergen, J. N., Alder, J., Thorne, G. M., Tally, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daptomycin:+a+lipopeptide+antibiotic+for+the+treatment+of+serious+Gram-positive+infections.">Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the treatment of serious Gram-positive infections.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 283-288 (2005).</li><li>Garcia, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MacFarlan+Standards.">MacFarlan Standards.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition. , (2010).</li><li>NanolR-2 System Manual. Anasys Instruments Available from: <a target="_blank" href="https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf">https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf</a> (2020)</li><li>Whelan, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+an+en+masse+and+reversible+B-+to+A-DNA+conformational+transition+in+prokaryotes+in+response+to+desiccation.">Detection of an en masse and reversible B- to A-DNA conformational transition in prokaryotes in response to desiccation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (97), 20140454 (2014).</li><li>McGuinness, W. A., Malachowa, N., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vancomycin+Resistance+in+Staphylococcus+aureus.">Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (2), 269-281 (2017).</li><li>Howden, B. P., Peleg, A. Y., Stinear, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+vancomycin+intermediate+Staphylococcus+aureus+(VISA)+and+heterogenous-VISA.">The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA.</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 21, 575-582 (2014).</li><li>Perez-Guaita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Atomic+Force+Microscopy-Infrared+Nano-Imaging+of+Malaria+Infected+Red+Blood+Cells.">Multispectral Atomic Force Microscopy-Infrared Nano-Imaging of Malaria Infected Red Blood Cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3140-3148 (2018).</li></ol>

Vorremmo ringraziare Bruker per il pagamento della tassa di pubblicazione. KK, BRW, AP e PH sono inventori di un brevetto internazionale (PCTIB2020/052339), che descrive alcuni degli aspetti fondamentali dell'approccio.

L'utilità della spettroscopia IR per la caratterizzazione di una vasta gamma di campioni biologici nel contesto della loro composizione chimica è ben consolidata. Negli ultimi dieci anni, la spettroscopia IR è emersa come uno strumento promettente per gli studi batterici12,13,14,15,16,17. Continua ad attirare un notevole interesse nel campo della microbiologia, come una delle poche tecniche che consentono una caratterizzazione fenotipica attraverso la composizione chimica. In questo contesto, il principale svantaggio della microscopia FTIR convenzionale risiede nella limitata risoluzione spaziale, impedendo studi su singole cellule e subcellulari sui batteri. In effetti, le piccole dimensioni dei batteri rappresentano un impedimento non solo per l'IR, ma per la stragrande maggioranza delle tecniche. Pertanto, gli strumenti di ricerca disponibili per gli studi su singole cellule e subcellulari sui batteri sono significativamente limitati. La combinazione di AFM con IR consente di superare la limitazione della risoluzione spaziale della spettroscopia IR, fornendo un nuovo strumento per la ricerca batterica, in grado di sondare su scala nanometrica la composizione chimica.
La tecnica non si limita agli studi su singole cellule e consente di sondare una varietà di campioni, di spessore vario. Indubbiamente, una preparazione del campione pulita e attenta è fondamentale per ottenere immagini di alta qualità. Il protocollo qui fornito fornisce un metodo per preparare campioni multistrato, monostrato e/o a singola cellula di vari batteri (Figura 1). Il campione preparato dipende da diversi fattori, tra cui la carica batterica iniziale, la diluizione post-lavaggio e un'ulteriore diluizione sul substrato. La quantità di campione ottenuta dopo aver diluito il pellet lavato e prima della deposizione sul substrato consente tipicamente la preparazione di numerosi campioni. Pertanto, per ottenere la distribuzione desiderata del campione sul substrato, è spesso utile preparare una serie di campioni, che vanno nella loro diluizione. Per gli studi finalizzati alla raccolta di spettri AFM-IR piuttosto che all'imaging subcellulare, modificare la quantità di campione (ad esempio, da monostrato a multistrato) può essere utile per aumentare l'intensità del segnale.
Un altro aspetto critico nella preparazione del campione è l'appropriata rimozione dei residui medi. A seconda dei metodi di coltivazione del campione selezionati, il campione viene raccolto da un mezzo liquido o da una piastra di agar. In entrambi i casi, è probabile che il residuo medio sia presente nel campione, anche se in misura molto minore al momento della raccolta da piastre di agar. Poiché i mezzi di crescita batterica contengono un'abbondanza di vari componenti biologici, è fondamentale garantire un'adeguata rimozione del mezzo. Raccomandiamo tre lavaggi con acqua ultrapura per i campioni di piastre di agar e almeno quattro lavaggi per i campioni raccolti dal mezzo. Il numero di lavaggi può essere aumentato, se necessario; tuttavia, per il confronto tra vari campioni, è importante mantenerlo coerente tra i campioni. Il protocollo dimostrato utilizza acqua, piuttosto che solventi come la soluzione tampone fosfato (PBS) o la soluzione salina. Sia pbS che soluzione salina portano alla formazione di cristalli dopo l'essiccazione all'aria, che può danneggiare i batteri. Inoltre, entrambi sono una fonte di bande IR intense, con PBS, in particolare, contenente più bande nella regione delle impronte digitali. La mancanza di capacità per l'uso di soluzione salina o PBS, rappresenta attualmente un limite importante per la tecnica. Tipicamente, l'uso di acqua per il lavaggio non causa alcuna influenza distruttiva sui batteri; tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione e, se possibile, il tempo di esposizione all'acqua dovrebbe essere limitato. Se il protocollo di preparazione del campione deve essere messo in pausa nella fase di lavaggio, si consiglia di lasciare il campione in forma pellettizzata dopo aver rimosso l'acqua. Questo è di particolare importanza per i batteri Gram-negativi, contenenti una parete cellulare più sottile in quanto sono più inclini alla rottura.
Per garantire dati AFM-IR adeguati e di alta qualità, diversi aspetti del protocollo di raccolta dati sono di fondamentale importanza. In primo luogo, la corretta raccolta dello sfondo è essenziale per l'acquisizione dei dati. In particolare, è necessario il mantenimento di livelli di umidità stabili durante tutta la raccolta dello sfondo e tra la raccolta dello sfondo e del campione. Per garantire ciò, si consiglia di spurgare lo strumento con azoto e mantenere i livelli di umidità non superiori al 25%. La mancanza di spurgo può imporre una limitazione significativa, in particolare in luoghi con elevata umidità. In secondo luogo, dovrebbe essere evidenziata l'importanza di una corretta ottimizzazione dei punti IR. Per ottenere i migliori risultati, la conoscenza a priori della posizione dei massimi di banda può essere utile. Ad esempio, uno spettro IR convenzionale di pellet batterico può essere utilizzato per determinare le posizioni delle bande attese da un campione. Se ciò non è possibile acquisire, come approccio alternativo, l'utente può utilizzare gli spettri IR disponibili in letteratura o iniziare l'ottimizzazione utilizzando una posizione di banda che è ragionevole aspettarsi nel batterio (ad esempio, ammide I e ammide II). In terzo luogo, per la raccolta dei dati, è importante sottolineare l'importanza di un'attenta selezione della potenza (che consente di ottenere un buon rapporto S / N), in quanto può avere un effetto distruttivo. La potenza consigliata dipende dallo spessore del campione, con guida approssimativa disponibile nel manuale dello strumento31. Raccomandiamo di testare empiricamente lo stato del campione post-misurazione mediante la raccolta di un'immagine AFM, in quanto rivelerà qualsiasi influenza distruttiva. Inoltre, la raccolta di immagini AFM dalla stessa area prima e dopo la raccolta di spettri AFM-IR serve come una buona conferma che non si è verificata alcuna deriva e che gli spettri provengono effettivamente dal punto selezionato nella cellula. La possibilità di deriva è particolarmente importante quando si applica la modalità di imaging, attraverso l'imaging consecutivo dell'intensità IR a valori di numero d'onda selezionati. Un esempio di questo è illustrato nella Figura 5. L'area definita all'inizio dell'esperimento è stata definita ed è pensata per essere coerente per tutti i valori del numero d'onda. Tuttavia, è visibile una chiara deriva tra ogni immagine di altezza AFM (e l'intensità del numero d'onda IR corrispondente), con un tempo di acquisizione di ciascuna mappa di circa 40 minuti. Per questo ciò, per gli utenti che raccolgono dati di imaging, si consiglia di selezionare sempre un'area leggermente più grande del campione di interesse, per garantire che anche in caso di esistenza di deriva, il campione di interesse rimanga all'interno dell'area stessa.
I potenziali limiti del protocollo includono la mancanza di capacità di raccogliere dati in uno stato idratato nelle soluzioni fisiologiche (ad esempio, soluzione salina o PBS) sopra descritte. Inoltre, soprattutto nelle aree ad alta umidità, c'è spesso bisogno di spurgo dell'azoto. Inoltre, il protocollo consente di sondare organismi fino a 100 nm di dimensione, escludendo la possibilità del suo utilizzo per strutture più piccole. Sebbene questo possa essere superato utilizzando un laser diverso (ad esempio, laser a cascata quantistica che consente di raggiungere la risoluzione spaziale di 20 nm), è anche associato a una gamma spettrale limitata e alle difficoltà nell'ottenere un buon rapporto segnale / rumore. Infine, il sondaggio di superfici morbide può rappresentare una sfida con la punta che non rileva correttamente la superficie e procede oltre il punto di contatto, fino alla rottura. Anche se questo in genere non è un problema con i campioni batterici, può verificarsi su misurazioni di campioni più morbidi. In questi casi, si consiglia di tentare di impegnarsi sulla superficie pulita del substrato in prossimità del campione.
Il protocollo descritto può essere utilizzato per numerosi tipi di ricerca batterica, compresi studi comparativi tra vari campioni e l'esame subcellulare. I dati possono essere analizzati utilizzando approcci chemiometrici per singoli spettri e modalità di imaging35, a seconda dello scopo della ricerca. Inoltre, il protocollo può anche essere modificato per l'applicazione ad altro materiale biologico (come funghi, lieviti, cellule, ecc.), attraverso l'aggiunta di fissazione.

I batteri sono organismi procariotici a singola cellula, che si verificano in varie forme e dimensioni, in genere nell'intervallo da diverse centinaia di nanometri a micrometri. Esistono in una varietà di habitat e sono essenziali per l'esistenza della vita. All'interno del corpo umano, la maggior parte dei batteri presenti nell'intestino sono innocui e molti sono infatti benefici1. Tuttavia, diverse specie batteriche sono patogene e causano una serie di malattie infettive. Le infezioni batteriche possono portare allo sviluppo di sepsi e shock settico: una condizione pericolosa per la vita, derivante dalla risposta del corpo a un'infezione2. La sepsi è una grave minaccia per la salute globale, con un'alta prevalenza in tutto il mondo e gravi tassi di mortalità. Solo nel 2017, circa 50 milioni di casi di sepsi sono stati registrati in tutto il mondo, con 11 milioni di quelli che hanno provocato la morte (circa il 20%)2. Inoltre, una diminuzione delle possibilità di sopravvivenza del paziente, a causa del ritardo della terapia, ha dimostrato di verificarsi in modo orario3,4.
Le infezioni batteriche sono trattate con antibiotici. La gravità delle potenziali conseguenze delle infezioni batteriche del flusso sanguigno (BSI), insieme a un chiaro significato di un rapido inizio della terapia antimicrobica, richiedono la necessità di una somministrazione immediata di antibiotici. Tuttavia, poiché gli attuali approcci diagnostici utilizzati nella pratica clinica (ad esempio, la coltura del sangue) richiedono un tempo relativamente lungo, la somministrazione di antibiotici avviene spesso prima della diagnosi di BSI positiva5. Questo fattore porta a un ampio uso eccessivo di antibiotici, che – insieme all'uso eccessivo di antibiotici in altri settori come l'agricoltura – crea una forte pressione evolutiva verso lo sviluppo della resistenza antimicrobica (AMR)6,7. La resistenza antimicrobica è attualmente uno dei problemi di salute globale piùurgenti 7,8 e, entro il 2050, si prevede che diventerà la principale causa di morte9. Lo sviluppo della resistenza, insieme alla diffusione dei ceppi di AMR si sta verificando ad un ritmo allarmante7,8,9 e supera, di gran lunga, il tasso di scoperta di nuovi antibiotici10. Nuovi fenotipi resistenti emergono continuamente in tutto il mondo, mentre la ricerca dedicata alla comprensione dei cambiamenti correlati alla resistenza antimicrobica è spesso lenta e limitata dagli approcci disponibili11. Inoltre, i metodi comunemente usati, come la reazione a catena della polimerasi (PCR) e il sequenziamento dell'intero gene (WGS), si concentrano solo sui cambiamenti genotipici. Questi non sono sufficienti a rivelare i meccanismi di resistenza11, spingendo un urgente bisogno di uno strumento di ricerca che consenta di comprendere la composizione chimica dei batteri.
La spettroscopia infrarossa (IR) fornisce una caratterizzazione molecolare del campione ed è quindi un candidato promettente per il sondaggio batterico fenotipico. Fin dalle sue prime applicazioni12, una grande grandezza di esempi del suo uso è stata dimostrata nella letteratura13,14. Questi includono l'identificazione fenotipica dei batteri sul genere15,specie16e ceppo17,livello 18. Tuttavia, la risoluzione spaziale dell'IR convenzionale è limitata a diversi micron a causa del limite di risoluzione spaziale di diffrazione della lunghezza d'onda19. Poiché la dimensione della maggior parte dei batteri si trova al di sotto di tale limite (ad esempio, Staphylococcus aureus ≈ 400 nm di diametro), l'IR convenzionale non è applicabile per il sondaggio a livello a cellula singola o intracellulare.
La limitazione della risoluzione spaziale è stata recentemente superata combinando la spettroscopia IR con la microscopia a forza atomica (AFM-IR). In questo caso, l'assorbimento IR viene rilevato indirettamente, attraverso l'espansione termica del materiale19,20,21,22. In breve, l'assorbimento della radiazione IR si traduce in un aumento della temperatura locale. Questo può essere misurato sia direttamente23 che attraverso la misurazione dell'oscillazione della sonda a sbalzo AFM, risultante dall'impulso di forza creato dall'assorbimento IR20,21. La tecnica combinatoria AFM-IR consente di raggiungere una risoluzione spaziale che si avvicina ai 20 nm, fornendo informazioni simultanee sulle proprietà fisiche locali di un campione (AFM) e sulla sua composizione chimica (AFM-IR). Sono possibili la raccolta di entrambi, singoli spettri da punti selezionati e la mappatura dell'intensità dei valori di numero d'onda selezionati all'interno di un'area scelta.
Considerando la risoluzione spaziale raggiungibile di AFM-IR, è evidente che la tecnica apre la possibilità di sondare chimicamente/fenotipicamente singole cellule batteriche e la loro composizione intracellulare24. Finora, diversi esempi dell'applicazione di AFM-IR per singoli batteri sono stati dimostrati in letteratura19,20,21,22,25,26,27,28. Questi coinvolgono l'analisi spettrale singola19,21,22 e la mappatura a livello subcellulare19,22,25,26,27,28. Ad esempio, è stata descritta la capacità di rilevare le vescicole lipidiche intracellulari27 e i virus28 all'interno di un singolo batterio. Questi risultati dimostrano l'utilità di AFM-IR per studi su scala nanometrica di singoli batteri e patogeni clinicamente rilevanti19.
Quindi, presentiamo un metodo di preparazione e raccolta del campione per i dati AFM-IR di campioni batterici multistrato, monostrato e monocellulare. Il protocollo qui descritto è stato applicato per studiare diverse specie di batteri22 e i cambiamenti nella loro composizione chimica. In particolare, lo sviluppo in vivo della resistenza alla vancomicina e della non suscettibilità alla daptomicina è stato studiato in coppie cliniche di S. aureus19. Sia la resistenza intermittente alla vancomicina che la non suscettibilità alla daptomicina in S. aureus (VISA e DpR) sono emerse relativamente di recente, a seguito dell'aumento dell'uso e dell'introduzione di questi antibiotici nelle cliniche, costituendo un problema medico significativo. Inoltre, in particolare, il meccanismo di non suscettibilità alla daptomicina rimane ancora sfuggente, ostacolando lo sviluppo di farmaci alternativi19,29. Il protocollo presentato si concentra sulla fornitura di spettri AFM-IR affidabili di singoli batteri, che possono essere ulteriormente analizzati utilizzando una varietà di approcci chemiometrici, secondo gli obiettivi sperimentali. Include inoltre l'approccio di mappatura, che è applicabile per gli studi intracellulari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM metal specimen disc</td>
			<td>PST ProSciTech Pty Ltd</td>
			<td>GA530-15</td>
			<td>Recommended 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anasys AFM-IR nanoIR2</td>
			<td>Anaysys Instruments</td>
			<td>0</td>
			<td>model: nanoIR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2</td>
			<td>Bruker / Anasys Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Model: Model: PR-EX-NIR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td>-</td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Heathrow Scientific&#160;</td>
			<td>HEA4323</td>
			<td>Can be replaced with any other micro-centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoIR 2 instrument</td>
			<td>Bruker / Anasys Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLS toolbox</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td>-</td>
			<td>GUI for Matlab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PP2001</td>
			<td>Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selected bacterial strain</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate (e.g. Raman grade CaF2)</td>
			<td>Crystran</td>
			<td>CAFP13-2R</td>
			<td>Recommended size: 13 mm &#216; x 2.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-C</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 0.5-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy combined with infrared spectroscopy as a tool to probe single bacterium chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) è una nuova tecnica combinatoria, che consente la caratterizzazione simultanea delle proprietà fisiche e della composizione chimica del campione con risoluzione su scala nanometrica. Combinando AFM con IR, viene superata la limitazione della risoluzione spaziale dell'IR convenzionale, consentendo di raggiungere una risoluzione di 20-100 nm. Ciò apre la porta a una vasta gamma di nuove applicazioni dell'IR verso il sondaggio di campioni più piccoli di diversi micrometri, precedentemente irraggiungibili mediante la microscopia IR convenzionale. AFM-IR è eminentemente adatto per la ricerca batterica, fornendo informazioni sia spettrali che spaziali a livello di singola cellula e intracellulare. Le crescenti preoccupazioni per la salute globale e le previsioni future sfavorevoli riguardanti le infezioni batteriche e, in particolare, il rapido sviluppo della resistenza antimicrobica, hanno creato un urgente bisogno di uno strumento di ricerca in grado di sondare fenotipicamente a livello di singola cellula e subcellulare. AFM-IR offre il potenziale per rispondere a questa esigenza, consentendo la caratterizzazione dettagliata della composizione chimica di un singolo batterio. Qui forniamo un protocollo completo per la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati dei singoli spettri e la modalità di mappatura, per l'applicazione di AFM-IR verso studi batterici.

Il protocollo descritto consente di ottenere una serie di tipi di distribuzioni cellulari di batteri sul substrato, a seconda della concentrazione iniziale del campione e della quantità di acqua aggiunta. La Figura 1 illustra gli esempi di immagini AFM (altezza e deflessione) registrate da monostrati e campioni monocellulari preparati utilizzando il protocollo descritto da batteri Gram-positivi(S. aureus)e Gram-negativi(Escherichia coli).
Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per l'imaging AFM-IR di strutture intra ed extracellulari di singoli batteri. Un esempio di questa applicazione è mostrato nella Figura 2, che dimostra i risultati del monitoraggio dei cambiamenti chimici localizzati spazialmente che si verificano durante la divisione di una cellula di S. aureus. Sebbene l'essiccazione all'aria sia comunemente considerata un approccio di fissazione per la preparazione batterica, i batteri, per natura, mostrano una resistenza molto elevata a fattori esterni come la temperatura e sono stati segnalati per sopravvivere alla disidratazione32. I risultati qui presentati sono stati acquisiti da un campione essiccato all'aria. La formazione di un setto, che si verifica prima della divisione cellulare, è stata osservata e monitorata tramite imaging AFM (Figura 2A-D) mediante raccolta di 12 immagini della stessa area consecutivamente (raccolta di una singola immagine ≈ 20 min). La Figura 2A-D mostra 4 immagini AFM selezionate, con un tempo tra la raccolta di ciascuna immagine di circa 40 minuti. La struttura formata (setto) è alta 45 nm. Il setto formato è chiaramente visibile nelle immagini di altezza e deflessione AFM (Figura 2E-F). Gli spettri AFM-IR registrati dall'area cellulare e del setto (Figura 2G, punti di origine contrassegnati in Figura 2F) sono stati normalizzati alla banda ammidica I prima del confronto, per minimizzare l'influenza del diverso spessore del campione tra i punti di raccolta dei dati. Lo spettro AFM-IR del setto è caratterizzato da una maggiore intensità relativa delle bande a 1240 e 1090 cm-1 rispetto allo spettro AFM-IR raccolto dall'area cellulare. Questi sono attribuiti a gruppi di carboidrati e fosfodiesteri di componenti della parete cellulare (tra cui, ad esempio, peptidoglicano e acido teicoico)22.
Il protocollo descritto può anche essere utilizzato per il confronto di un singolo spettro tra un numero di campioni diversi. Un esempio di questa applicazione insieme ai risultati è mostrato nella Figura 3 e nella Figura 4. Lo scopo dello studio è determinare i cambiamenti chimici che si verificano a seguito dello sviluppo in vivo della resistenza intermittente alla vancomicina in S. aureus (VISA). A tal fine, sono state raccolte coppie cliniche di campioni da pazienti, con il ceppo genitore isolato al momento del ricovero in ospedale e prima della terapia antibiotica (vancomicina suscettibile S. aureus, VSSA) e il ceppo figlio isolato dallo stesso paziente dopo l'ammissione di antibiotici e l'insufficienza clinica. I campioni sono stati ulteriormente coltivati su terreno agar e preparati secondo il protocollo (Figura 3A-B). Gli spettri AFM-IR sono stati raccolti da più singoli batteri (e più campioni) per VSSA e VISA e successivamente analizzati utilizzando diversi approcci chemiometrici (Figura 3C).
Non sono state osservate differenze morfologiche tra cellule VSSA e VISA (Figura 4A–C). Tuttavia, gli spettri AFM-IR (Figura 4D,F) e i loro derivati secondi (Figura 4E,G) hanno dimostrato una chiara differenza nella composizione chimica tra ceppi resistenti e sensibili. L'intensità relativa delle bande associate ai gruppi di carboidrati e fosfodiestere dai componenti della parete cellulare (in particolare, la banda a 1088 cm-1) è chiaramente aumentata nel ceppo resistente, rispetto alla controparte suscettibile. Da notare il fatto che tutti gli spettri ricodificati (VISA: 81, VSSA: 88) mostrano una piccola deviazione standard. Ciò dimostra una buona riproducibilità dei dati registrati da vari campioni preparati dallo stesso ceppo, in quanto non era possibile alcuna discriminazione tra spettri registrati da campioni diversi dello stesso ceppo. Le differenze osservate hanno indicato un aumento dello spessore della parete cellulare in ceppi resistenti, rispetto alla controparte suscettibile, che rimane in accordo con altri rapporti di letteratura33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig01.jpg"> Figura 1: Immagini AFM rappresentative di vari campioni batterici per misurazioni AFM-IR. A seconda della diluizione sul substrato, il protocollo consente di ottenere multistrati e monostrati di batteri e campioni unicellulari. Immagini AFM rappresentative di: (A-D) monostrato e (E-H) campione monocellulare per (A, B, E, F) Gram-positivo (S. aureus) e (C, D, G, H) Gram negativo (E. coli) batteri. (A,C,E,G) mostrano immagini di altezza e (B,D,F,H) mostrano immagini di deflessione corrispondenti. Dimensioni delle aree immaginate: (A-D,G,H) 20 x 20 μm, (E,F) 50 x 50 μm. (I–K) selezione consecutiva di un'area per la mappatura AFM-IR. Ciò si ottiene utilizzando l'imaging AFM con risoluzione spaziale crescente nell'esempio di una singola cellula di S. aureus. Ogni immagine viene raccolta campionando 200 x 200 punti, con una risoluzione spaziale crescente dovuta alla riduzione delle dimensioni dell'area grafata. Dimensioni delle aree con immagini: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm e (K) 2,24 x 2,24 μm. Il quadrato nero in (I) segna l'area immaginata in (J). Il quadrato nero in (J) segna l'area immaginata in (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig02.jpg"> Figura 2: Monitoraggio della divisione cellulare di S. aureus tramite AFM-IR. (A–D) Immagini AFM della cellula di S. aureus che mostrano la formazione del setto prima della divisione cellulare. Dimensione dell'area dell'immagine: 2 x 2 μm. Le immagini sono state selezionate da una serie più ampia (12 immagini registrate ogni 20 min) e rappresentano i dati registrati ogni 40 min.(E-F)AFM altezza e deflessione dell'immagine registrata alla fine della formazione del setto cellulare con punti marcati di raccolta di spettri AFM-IR. Dimensioni dell'area grafata 1,17 x 1,15 μm. L'altezza della struttura appena formata è di 45 nm. (G) Spettri AFM-IR registrati dall'area cellulare (nera) e dall'area del setto (rosso) (contrassegnati in (F)), nell'intervallo 1400-900 cm-1. Entrambi gli spettri sono stati normalizzati alla banda ammidica I e dimostrano un aumento dell'intensità relativa dei componenti della parete cellulare dal setto. Questa figura è stata modificata da K. Kochan et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig03.jpg"> Figura 3: Una panoramica del progetto sperimentale per lo studio AFM-IR della resistenza antimicrobica. (A)Origine del campione e preparazione iniziale: il ceppo genitore suscettibile è stato raccolto da un paziente prima della terapia antibiotica e il ceppo resistente alla figlia è stato ottenuto dallo stesso paziente dopo terapia antibiotica e fallimento clinico (sviluppo di resistenza in vivo). I batteri sono stati isolati e coltivati all'agar heart infusion (HI) per 16 ore a 37 °C. B)Successiva preparazione del campione per aFM-IR, compresa la raccolta del campione seguita dal lavaggio della paletta batterica (3×) e dalla deposizione del campione. (C) Raccolta e analisi dei dati AFM-IR: altezza AFM e spettro AFM-IR (1800-900 cm-1). Dimensioni dell'area grafata AFM: 1,7 x 1,4 μm. Lo spettro AFM-IR è stato raccolto dal centro della cellula. I dati sono stati successivamente analizzati utilizzando approcci chemiometrici, compresa l'analisi gerarchica dei cluster. Questa figura è stata modificata da K. Kochan et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig04.jpg"> Figura 4: Risultati AFM e AFM-IR dello studio dei cambiamenti chimici nella vancomicina intermedia S. aureus (VISA) rispetto alla vancomicina suscettibile a S. aureus (VSSA) in coppie cliniche. Immagini AFM di campioni a cella singola (A-B) VISA e (C) VSSA. Dimensioni delle aree immaginate: (A,C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D-E) Spettri AFM-IR medi e loro derivati secondi (F-G) per: (D, F) celle VISA e (E, G) VSSA, nell'intervallo spettrale 1800-900 cm-1. Gli spettri presentati sono una media di 81 (VISA) e 88 (VSSA) spettri individuali e sono presentati insieme alla deviazione standard (SD). La media è stata condotta dopo la normalizzazione di tutti i singoli spettri insieme. Le bande maggiori sono contrassegnate in (F-G). Questa figura è stata modificata da K. Kochan et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig05.jpg"> Figura 5: Deriva dell'immagine sulla registrazione consecutiva di mappe AFM-IR a valori di numero d'onda selezionati per la cella di S. aureus.  (Riga superiore): Le immagini AFM sono state registrate contemporaneamente alle corrispondenti mappe AFM-IR(riga inferiore)in base all'intensità del segnale IR ai valori del numero d'onda selezionati. I valori del numero d'onda (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm-1) sono annotati sopra la riga inferiore. Ogni set (immagine AFM e mappa AFM-IR) è stato registrato direttamente dopo l'immagine precedente (circa 40 minuti per set). La dimensione dell'area grafata/mappata: 1,54 x 1,57 μm. Una chiara deriva è visibile tra le immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry at JoVE.com

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) fornisce una potente piattaforma per studi batterici, consentendo di raggiungere una risoluzione su scala nanometrica. Sia la mappatura dei cambiamenti subcellulari (ad esempio, sulla divisione cellulare) che gli studi comparativi della composizione chimica (ad esempio, derivanti dalla resistenza ai farmaci) possono essere condotti a livello di singola cellula nei batteri.

Microscopia a forza atomica combinata con la spettroscopia infrarossa come strumento per sondare la chimica del singolo batterio

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

atomic-force-microscopy-combined-with-infrared-spectroscopy-as-tool

Research

JoVE Journal

Chemistry

3.7K Views.  Monash University. Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) fornisce una potente piattaforma per studi batterici, consentendo di raggiungere una risoluzione su scala nanometrica. Sia la mappatura dei cambiamenti subcellulari (ad esempio, sulla divisione cellulare) che gli studi comparativi della composizione chimica (ad esempio, derivanti dalla resistenza ai farmaci) possono essere condotti a livello di singola cellula nei batteri.

Video: Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Ricerca

Chimica

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

Spettroscopia NMR come uno strumento robusto per la rapida valutazione del profilo lipidico di olio di pesce integratori

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Coulomb Explosion Imaging as a Tool to Distinguish Between Stereoisomers

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish between enantiomers (stereoisomers) of simple chiral species on the level of individual molecules. In this approach, a gaseous molecular jet of the sample expands into a vacuum chamber and intersects with femtosecond (fs) laser pulses. The high intensity of the pulses leads to fast multiple ionization, igniting a so-called Coulomb Explosion that produces several cationic (positively charged) fragments. An electrostatic field guides these cations onto time- and position-sensitive detectors. Similar to a time-of-flight mass spectrometer, the arrival time of each ion yields information on its mass. As a surplus, the electrostatic field is adjusted in a way that the emission direction and the kinetic energy after fragmentation lead to variations in the time-of-flight and in the impact position on the detector.
Each ion impact creates an electronic signal in the detector; this signal is treated by high-frequency electronics and recorded event by event by a computer. The registered data correspond to the impact times and positions. With these data, the energy and the emission direction of each fragment can be calculated. These values are related to structural properties of the molecule under investigation, i.e. to the bond lengths and relative positions of the atoms, allowing to determine molecule by molecule the handedness of simple chiral species and other isomeric features.

For small chiral species, Coulomb Explosion Imaging provides a new approach to determine the handedness of individual molecules.

Formazione immagine di esplosione Coulombiana come uno strumento per distinguere tra stereoisomeri

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

Spettroscopia di impedenza elettrochimica come uno strumento per la stima della costante tasso elettrochimica

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using visible-range light. The purpose of this protocol is to detail a proven method for preparing plasmonic nanoparticle samples and performing single particle spectroscopy on them with DIC microscopy. Several important steps must be followed carefully in order to perform repeatable spectroscopy experiments. First, landmarks can be etched into the sample substrate, which aids in locating the sample surface and in tracking the region of interest during experiments. Next, the substrate must be properly cleaned of debris and contaminants that can otherwise hinder or obscure examination of the sample. Once a sample is properly prepared, the optical path of the microscope must be aligned, using Kohler Illumination. With a standard Nomarski style DIC microscope, rotation of the sample may be necessary, particularly when the plasmonic nanoparticles exhibit orientation-dependent optical properties. Because DIC microscopy has two inherent orthogonal polarization fields, the wavelength-dependent DIC contrast pattern reveals the orientation of rod-shaped plasmonic nanoparticles. Finally, data acquisition and data analyses must be carefully performed. It is common to represent DIC-based spectroscopy data as a contrast value, but it is also possible to present it as intensity data. In this demonstration of DIC for single particle spectroscopy, the focus is on spherical and rod-shaped gold nanoparticles.

The goal of this protocol is to detail a proven approach for the preparation of plasmonic nanoparticle samples and for performing single particle spectroscopy on them with differential interference contrast (DIC) microscopy.

Eseguire la spettroscopia su nanoparticelle plasmoniche con microscopia a contrasto di tipo Nomarski basata su trasmissione

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids with adsorbates. Vibrational spectra provide information on the chemical nature of adsorbed species and their structure. Thus, they are very useful for obtaining molecular level understanding of surface species. The IR spectrum of the sample itself gives some direct information about the material. General conclusions can be drawn concerning hydroxyl groups, some stable surface species and impurities. However, the spectrum of the sample is &#34;blind&#34; with respect to the presence of coordinatively unsaturated ions and gives rather poor information about the acidity of surface hydroxyls, species decisive for the adsorption and catalytic properties of the materials. Furthermore, no discrimination between bulk and surface species can be made. These problems are solved by the use of probe molecules, substances that interact specifically with the surface; the alteration of some spectral features of these molecules as a result of adsorption provides valuable information about the nature, properties, location, concentration, etc., of the surface sites.
The experimental protocol for in-situ IR studies of gas/sample interaction includes preparation of a sample pellet, activation of the material, initial spectral characterization through the analysis of the background spectra, characterization by probe molecules, and study of the interaction with a particular set of gas mixtures. In this paper we investigate a zirconium terephthalate metal organic framework, Zr6O4(OH)4(BDC)6 (BDC = benzene-1,4-dicarboxylate), namely UiO-66 (UiO refers to University of Oslo). The acid sites of the UiO-66 sample are determined by using CO and CD3CN as molecular probes. Furthermore, we have demonstrated that CO2 is adsorbed on basic sites exposed on dehydroxylated UiO-66. Introduction of water to the system produces hydroxyl groups acting as additional CO2 adsorption sites. As a result, CO2 adsorption capacity of the sample is strongly enhanced.

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

The use of FTIR spectroscopy for investigation of the surface properties of polycrystalline solids is described. Preparation of sample pellets, activation procedures, characterization with probe molecules and model studies of CO2 adsorption are discussed.

In situ Spettroscopia FTIR come strumento per lo studio dell'interazione gas/solido: adsordimento di CO2 potenziato con acqua in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids ...

Characterizing Lewis Pairs Using Titration Coupled with In Situ Infrared Spectroscopy

Lewis acid-activation of carbonyl-containing substrates is a fundamental basis for facilitating transformations in organic chemistry. Historically, characterization of these interactions has been limited to models equivalent to stoichiometric reactions. Here, we report a method utilizing in situ infrared spectroscopy to probe the solution interactions between Lewis acids and carbonyls under synthetically relevant conditions. Using this method, we were able to identify 1:1 complexation between GaCl3 and acetone and a highly ligated complex for FeCl3 and acetone. The impact of this technique on mechanistic understanding is illustrated by application to the mechanism of Lewis acid-mediated carbonyl-olefin metathesis in which we were able to observe competitive binding interactions between substrate carbonyl and product carbonyl with the catalyst.

Here, we present a method for the observation of solution interactions between Lewis acids and bases by employing in situ infrared spectroscopy as a detector for titration under synthetically relevant conditions. By examining solution interactions, this method represents a complement to X-ray crystallography, and provides an alternative to NMR spectroscopy.

Caratterizzare le coppie lewis usando la titolazione accoppiata con la spettroscopia a infrarossi in Situ

Lewis acid-activation of carbonyl-containing substrates is a fundamental basis for facilitating transformations in organic chemistry. Historically, ...

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation of their functions in nature and potential human benefits (e.g., for drug discovery applications) are desired. This protocol describes the combination of genome mining (GM) and molecular networking (MN), two contemporary approaches that match gene cluster-encoded annotations in whole genome sequencing with chemical structure signatures from crude metabolic extracts. This is the first step towards the discovery of new natural entities. These concepts, when applied together, are defined here as MS-guided genome mining. In this method, the main components are previously designated (using MN), and structurally related new candidates are associated with genome sequence annotations (using GM). Combining GM and MN is a profitable strategy to target new molecule backbones or harvest metabolic profiles in order to identify analogues from already known compounds.

A mass spectrometry-guided genome mining protocol is established and described here. It is based on genome sequence information and LC-MS/MS analysis and aims to facilitate identification of molecules from complex microbial and plant extracts.

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining come strumento per scoprire nuovi prodotti naturali

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals

In this work, we describe a protocol for a novel application of hyperspectral imaging (HSI) in the analysis of luminescent lanthanide (Ln3+)-based molecular single crystals. As representative example, we chose a single crystal of the heterodinuclear Ln-based complex [TbEu(bpm)(tfaa)6] (bpm=2,2&#8217;-bipyrimidine, tfaa&#8211; =1,1,1-trifluoroacetylacetonate) exhibiting bright visible emission under UV excitation. HSI is an emerging technique that combines 2-dimensional spatial imaging of a luminescent structure with spectral information from each pixel of the obtained image. Specifically, HSI on single crystals of the [Tb-Eu] complex provided local spectral information unveiling variation of the luminescence intensity at different points along the studied crystals. These changes were attributed to the optical anisotropy present in the crystal, which results from the different molecular packing of Ln3+ ions in each one of the directions of the crystal structure. The HSI herein described is an example of the suitability of such technique for spectro-spatial investigations of molecular materials. Yet, importantly, this protocol can be easily extended for other types of luminescent materials (such as micron-sized molecular crystals, inorganic microparticles, nanoparticles in biological tissues, or labelled cells, among others), opening many possibilities for deeper investigation of structure-property relationships. Ultimately, such investigations will provide knowledge to be leveraged into the engineering of advanced materials for a wide range of applications from bioimaging to technological applications, such as waveguides or optoelectronic devices.

Here, we present a protocol to obtain luminescent hyperspectral imaging data and to analyze optical anisotropy features of lanthanide-based single crystals using a Hyperspectral Imaging System.

L'imaging iperspettrale come strumento per studiare l'anisotropia ottica nei cristalli singoli molecolari basati sul Lanthanide

In this work, we describe a protocol for a novel application of hyperspectral imaging (HSI) in the analysis of luminescent lanthanide (Ln3+)-based ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

Attacco covalente di singole molecole per la spettroscopia della forza basata su AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...