Gostaríamos de reconhecer Bruker pelo apoio deles. Este trabalho foi apoiado pela Monash University Advanceing Women's Success Grant (K. Kochan). A A.Y.P reconhece o apoio de uma Bolsa australiana do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (APP1117940). Este trabalho foi financiado por um Projeto de Descoberta do Conselho de Pesquisa Australiano DP180103484. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Finlay Shanks por seu apoio instrumental e à Sra. Xenia Kostoulias por sua assistência técnica com as amostras.

Todo o trabalho realizado com bactérias patogênicas deve ser realizado com as medidas de segurança adequadas em vigor. Estes incluem trabalhar em um laboratório com nível adequado de biossegurança e em uma cabine de biossegurança (PC2), bem como descontaminação cuidadosa da área de trabalho com uma solução adequada de desinfetante, por exemplo, 80% de etanol. Epi apropriado deve ser usado o tempo todo.
1. Preparação de solventes e materiais
<ol><li>Solventes: Use água ultrauso como solvente. Use água purificada, autoclaved antes do experimento para evitar qualquer potencial contaminação cruzada.</li>
	<li>Substrato: Use qualquer um desses substratos para AFM-IR, por exemplo, ZnSe, CaF2, BaF2, etc. Uma vez que o AFM-IR é, em princípio, uma técnica não destrutiva, pode-se aplicar uma variedade de outras ferramentas de pesquisa à mesma amostra pós-análise AFM-IR. Por exemplo, a correlação dos resultados com a espectroscopia de Raman pode ser realizada se forem utilizados slides caf2 ou BaF2 de grau Raman.</li>
	<li>Use frascos de vidro em vez de tubos plásticos, pois o plástico pode contaminar a amostra.</li>
</ol>2. Preparação da amostra para AFM-IR
<ol><li>Crescimento/incubação da amostra<ol>
<li>Cultivar bactérias em mídia líquida ou em placas sólidas. Selecione o tipo de condições médias de crescimento (por exemplo, temperatura, disponibilidade de oxigênio) e tempo de crescimento de acordo com os requisitos específicos das espécies de bactérias sob investigação. Por exemplo, para placas de ágar de infusão cardíaca S. aureus (HI), com crescimento de 16 h em 37 °C em condições aeróbicas. NOTA: Para alcançar os melhores resultados, o crescimento/incubação deve produzir bactérias suficientes que permitam a coleta de uma micro-pelota de amostra. O número específico de unidades formadoras de colônias ou células bacterianas depende do tipo e tamanho da bactéria.</li>
	</ol></li>
	<li>Depoimento de amostra<ol>
<li>Usando um laço estéril, colete cuidadosamente bactérias das colônias na placa de ágar e transfira-as para um tubo de vidro. Coletar bactérias apenas do topo das colônias. Se coletar amostras de uma cultura líquida, usando uma pipeta, transfira aproximadamente 1 mL da suspensão bacteriana para um tubo de vidro. O volume pode ser modificado dependendo da carga bacteriana. NOTA: É importante tentar não coletar (ou minimalizar o máximo possível a coleta de) qualquer meio de debaixo da colônia. As etapas subsequentes da preparação da amostra visam remover qualquer resíduo potencial da mídia. A minimização do resíduo médio potencial desde o início permite a aquisição espectral de dados de células bacterianas purificadas. As etapas 2.2.2 e 2.2.3 aplicam-se às amostras preparadas a partir de placas de ágar. Para amostras preparadas a partir de mídia líquida, mova-se para a etapa 2.2.4.</li>
		<li>Adicione 1 mL de água ultrapura ao tubo. Vórtice até que a pelota bacteriana coletada não esteja mais visível na parte inferior do tubo (tipicamente 1-2 min).</li>
		<li>Estimar a turbidez da solução usando, por exemplo, os padrões da McFarland por comparação visual30 entre a solução preparada e os padrões mcfarland. Se a turbidez da suspensão bacteriana parecer muito baixa, adicione mais bactérias da placa usando um laço estéril e vórtice novamente. Repita até que a turbidez da solução seja comparável às normas McFarland 0.5 e 1. Isso geralmente renderá uma boa quantidade de pelotas bacterianas.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão bacteriana a 3.000 x g por 5 min para obter uma pelota. NOTA: Os parâmetros de centrifugação podem ser modificados para obter pelotas bacterianas. Deve-se ter cuidado se aumentar a força G, para não induzir a quebra de bactérias (especialmente no caso de bactérias Gram-negativas).</li>
		<li>Usando uma pipeta, remova suavemente o sobrenatante de cima da pelota. Adicione 1 mL de água ultrauso ao tubo e vórtice para suspender a pelota. Posteriormente, centrifugar a amostra como foi feito na etapa 2.2.4.</li>
		<li>Repita o procedimento de lavagem (etapas 2.2.2 e 2.2.4) pelo menos três vezes. Em caso de coleta da amostra inicial a partir de mídia líquida, repita o procedimento pelo menos quatro vezes (remoção da mídia seguida de três lavagens).</li>
		<li>Após a lavagem final, remova o supernascente, adicione água ultrapura e vórtice por pelo menos 2 minutos. Posteriormente, deposite 5 μL da amostra no substrato (por exemplo, Grau Raman CaF2).</li>
		<li>Se a espessura desejada da amostra for uma multicamadas de bactérias, deixe a amostra para secar o ar.</li>
		<li>Se a espessura desejada for monocamada ou bactérias individuais, imediatamente após o depósito da amostra (etapa 2.2.7) adicione entre 20-100 μL de água ultrapura e misture suavemente com uma ponta de pipeta. Deixe secar ao ar. NOTA: O volume exato de água pode variar entre experimentos, pois depende de muitos fatores (por exemplo, tamanho do organismo, densidade da pelota, etc.) e é, portanto, melhor determinado empiricamente. A preparação de uma série de amostras com volumes variados de água ultrauso adicionada permite selecionar uma amostra com a espessura/densidade desejada das bactérias. A espessura/densidade das bactérias pode ser facilmente visualizada via AFM nos estágios subsequentes. Exemplos de imagens AFM de amostras de monocamadas e células únicas são mostrados na Figura 1A-H.</li>
		<li>Monte o substrato em um disco de amostra de metal AFM usando fita adesiva de dois lados.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação do instrumento
NOTA: Os procedimentos instrumentais aqui descritos são para o instrumento listado na Tabela de Materiais. O procedimento instrumental detalhado pode diferir ligeiramente do descrito aqui se utilizar um modelo mais novo do instrumento AFM-IR.
<ol><li>Ligue e inicialize o instrumento pressionando o botão Initialize. Certifique-se de que o obturador a laser está na posição Aberta para o teste a laser.</li>
	<li>Se um sistema de purga estiver configurado, purgue o instrumento com N2 ligando o fluxo de N2. Ajuste o expurgo de nitrogênio para atingir um nível de umidade estável (por exemplo, 20%). Certifique-se de que a umidade não flutua durante as medições e entre a coleta de dados de fundo e amostra. Recomenda-se permitir que aproximadamente 20 minutos para que os níveis de umidade se estabilizem.</li>
	<li>Carregue a amostra na câmara de amostra pressionando o botão Carregar. O carregamento de amostras é realizado através do assistente de software. Durante a operação do assistente de software, primeiro foque na ponta, usando setas para mover o estágio do microscópio na direção Z e clique em Next. Em segundo lugar, ajuste o ponto de coleta de dados, usando setas que guiam o movimento do plano e alinhe o laser AFM e o detector AFM usando os botões na parte superior da cabeça AFM. Posteriormente, concentre-se na superfície da amostra movendo o estágio do microscópio na direção Z. NOTA: Ilustrações detalhadas de cada etapa de carregamento de amostras são fornecidas no manual de software31. O foco na amostra deve ser conduzido com cuidado. Ao se aproximar da superfície da amostra na direção Z, use uma velocidade lenta do motor.</li>
	<li>Aproxime-se da amostra sem se envolver clicando no botão Abordagem.</li>
</ol>4. Coleta de dados
<ol><li>Fundo<ol>
<li>Antes da aquisição de dados, colete o fundo. Para coleta de fundo, certifique-se de que o obturador a laser esteja na posição Aberta. Selecione a faixa e resolução espectral (dependendo do objetivo da análise) e o número de varreduras e número de co-médias de fundo. Estes são geralmente recomendados para ser alto (por exemplo, 1024 scans e 3 co-médias). NOTA: Em geral, recomenda-se resolução espectral de 4 cm-1 ou 8 cm-1 e faixas espectrais de 3.200 cm-1–1 -1e 1.800 cm-1-900 cm-1.</li>
		<li>Após a aquisição do fundo, salve o arquivo de fundo. O arquivo não é armazenado automaticamente. Altere a posição do obturador a laser para fechar.</li>
	</ol></li>
	<li>Amostra – espectro único<ol><li>Pressione o botão Engajar para engatar na amostra. O sistema começará a se aproximar da superfície da amostra, até que o contato direto seja detectado. NOTA: O set point usado neste trabalho variou entre 0,15-2 V e os ganhos de feedback (I Gain e P Gain) normalmente seriam definidos para 3 e 10. As sondas de contato NIR2 são comumente usadas com sistema nanoIR2 (modelo: PR-EX-nIR2-10, frequência de ressonância (kHz): 13 +/−4 kHz, constante de mola (N/m): 0,07-0,4 Nm-1).</li>
		<li>Colete uma imagem AFM para visualizar a superfície. Em primeiro lugar, escaneie uma área maior (por exemplo, 50 x 50 μm) com menor resolução espacial (por exemplo, 200 x 200 pontos)(Figura 1I). NOTA: Os dados AFM-IR são sempre coletados no modo de contato, no entanto, os dados AFM podem ser coletados no modo de contato ou toque.</li>
		<li>A partir da imagem de altura/deflexão afm, selecione uma área específica de interesse e reimagem-a com maior resolução espacial(Figura 1J-K). Certifique-se de que a velocidade de coleta de dados seja adequada, com movimento de ponta lenta (por exemplo, Taxa de Varredura 0,2-0,4 Hz).</li>
		<li>Selecione o ponto de medição (por exemplo, uma única bactéria) e mova a ponta para o local.</li>
		<li>Alinhe o laser IR. Para isso, use um número de ondas no qual a amostra absorverá. Para materiais biológicos, isso pode ser, por exemplo, amide I (1655 cm-1). Certifique-se de que o filtro de passe de banda está desligado e clique em Iniciar IR. O gráfico direito no medidor nanoIR (FFT da deflexão exibida como amplitude versus frequência) deve mostrar pelo menos um pico claro e o gráfico esquerdo (deflexão versus tempo) deve ter uma forma de onda periódica. Se esse não for o caso, proceda para otimizar as manchas de IR. NOTA: Mesmo que o Fast Fourier Transform (FFT) e o perfil esperado de deflexão, é recomendável realizar a otimização de pontos de IR para pelo menos vários números de ondas, onde as bandas são esperadas.</li>
		<li>Otimize os pontos quentes para a coleta de dados de RI usando os valores de número de ondas selecionados. Pode ser útil usar um espectro de IR convencional das bactérias (por exemplo, espectro ATR de pelotas bacterianas) para identificar as posições das bandas e usá-las para otimizar os pontos quentes. Selecione vários valores de número de ondas (por exemplo, 8-10) de várias regiões espectrais. NOTA: Se o espectro convencional de bactérias de interesse não pôde ser coletado antes da coleta de dados AFM-IR, os espectros bacterianos disponíveis na literatura podem ser usados como orientação áspera. O resultado da otimização de um ponto de IR é uma imagem, que apresenta um mapa do sinal de magnitude FFT em cada local x e y. O local com maior sinal é selecionado automaticamente. Exemplos dessas imagens são dados no manual do software31.</li>
		<li>Depois de otimizar os pontos de IR para valores de número de ondas selecionados, defina os parâmetros da coleta de dados espectrais: região espectral, resolução espectral, número de varreduras e energia aplicada e insumo-os nas janelas apropriadas do software. A resolução espectral deve corresponder à resolução de fundo e a região espectral deve estar dentro da região espectral para a qual foi coletado o fundo. NOTA: Um conjunto inicial genérico de parâmetros poderia ser: faixa espectral: 3200 cm-1-2800 cm-1 e 1800 cm-1–900 cm-1, resolução espectral: 4 cm-1 ou 8 cm-1, número de varreduras: 512-2048.</li>
		<li>Se necessário, ajuste a potência do laser dependendo do sinal. Em geral, valores entre 8%-10% de potência laser devem ser suficientes para uma boa qualidade de sinal. Valores mais elevados podem ser usados com cautela, pois podem resultar em danos amostrais. NOTA: A potência por cento do laser pode variar dependendo do tipo de laser IR. Os valores por cento dados aqui são para laser OPO.</li>
		<li>Clique em Adquirir para coletar o espectro AFM-IR.</li>
		<li>Recolha os dados AFM da mesma área após a coleta do espectro AFM-IR. Isso é altamente recomendado, pois revelará qualquer potencial deriva e/ou influência destrutiva na amostra.</li>
		<li>Se o espectro AFM-IR for satisfatório e nenhuma influência destrutiva na amostra for observada, proceda à coleta de dados. Se necessário, defina uma série de pontos para coleta de dados usando a opção Array e colecione a altura ou a imagem de deflexão da AFM. Esta opção permite coletar espectros consecutivamente de cada ponto com os mesmos parâmetros espectrais definidos para um único espectro.</li>
		<li>Se a imagem AFM coletada após a coleta do espectro AFM-IR revelar influência destrutiva na amostra (tipicamente um ponto queimado), reduza a potência; selecione um local diferente e repita as etapas 4.3.8-4.3.11.</li>
		<li>Se o sinal no espectro AFM-IR não for satisfatório, verifique a correção da otimização das manchas de RI (etapa 4.3.6). Se estiver correto, aumente ligeiramente a potência do laser e repita as etapas 4.3.7-4.3.11. Isso pode ser repetido até que o sinal satisfatório seja alcançado.</li>
	</ol></li>
	<li>Amostra – abordagem de imagem NOTA: É altamente recomendável registrar um único espectro AFM-IR da bactéria antes de coletar uma imagem de distribuição de intensidade para um valor de número de ondas selecionado.<ol>
<li>Registo uma imagem AFM da área amostral escolhida. Para isso, primeiro colete a imagem AFM de uma área maior com menor resolução espacial (por exemplo, 50 x 50 μm, 200 x 200 pontos), depois selecione uma região de interesse e colete uma imagem AFM com maior resolução espacial (conforme ilustrado na Figura 1I-K).</li>
		<li>Selecione os valores de número de ondas para imagens AFM-IR.</li>
		<li>Certifique-se de que a mancha de IR do laser seja otimizada para os valores de número de ondas selecionados (etapa 4.3.6). Se o ponto ir não for otimizado para alguns números de ondas (sem máximo claro), otimize-o para eles.</li>
		<li>Defina os parâmetros da área imagem: largura e altura, número de pontos de dados na direção X e Y. NOTA: Se a seleção consecutiva de pontos das imagens AFM anteriores for aplicada (como demonstrado na Figura 1I-K),os campos de largura e altura serão automaticamente preenchidos, após a marcação da área.</li>
		<li>Defina os parâmetros de aquisição de sinal espectral: o comprimento de onda, o número de varreduras e a potência do laser. NOTA: O número de exames precisa ser mantido dentro da razão. 64 ou 32 varreduras normalmente permitirão uma quantidade suficiente de sinal.</li>
		<li>Defina os parâmetros do movimento da ponta AFM clicando na Taxa de Varredura. Quanto maior o número de varreduras na etapa anterior e o número de pontos de dados na direção X, mais lento será o movimento da ponta. A falta de ajuste entre esses parâmetros resultará em um movimento muito rápido da ponta, impedindo a aquisição real do número definido de varreduras de cada ponto. NOTA: Por exemplo, para uma coleta adequada de sinal IR com 64 co-adições e 200 pontos, defina a Taxa de Varredura como 0,07 kHz.</li>
		<li>Certifique-se de que a caixa de imagem Enable IR esteja marcada.</li>
		<li>Comece a imagem. AFM-IR da intensidade do sinal no número de ondas selecionado será coletado simultaneamente com os dados AFM dessa área. NOTA: Quando o laser OPO é usado, é possível coletar simultaneamente a imagem de frequência de pico de ressonância. Isso pode ser usado para obter informações sobre a rigidez relativa da amostra em diferentes locais.</li>
		<li>Use a janela Sequência de captura para definir uma coleção consecutiva de dados AFM-IR da mesma área com os mesmos parâmetros, mas para diferentes valores de número de ondas. Para isso, abra a janela Sequência de captura, digite cada número de ondas e defina o poder laser aplicado (para cada número de onda).</li>
		<li>Exporte os dados coletados (AFM e AFM-IR, espectro único e imagem) em vários formatos e analise-os utilizando métodos adequados para objetivos específicos de pesquisa.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Sears, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+partnership:+celebrating+our+gut+flora.">A dynamic partnership: celebrating our gut flora.</a> Anaerobe. 11 (5), 247-251 (2005).</li><li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+sepsis+incidence+and+mortality,+1990-2017:+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li><li>Seymour, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+treatment+and+mortality+during+mandated+emergency+care+for+sepsis.">Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (23), 2235-2244 (2017).</li><li>Weiss, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+antimicrobial+therapy+increases+mortality+and+organ+dysfunction+duration+in+pediatric+sepsis.">Delayed antimicrobial therapy increases mortality and organ dysfunction duration in pediatric sepsis.</a> Critical Care Medicine. 42 (11), 2409-2417 (2014).</li><li>Peker, N., Couto, N., Sinha, B., Rossen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+bloodstream+infections+from+positive+blood+cultures+and+directly+from+blood+samples:+recent+developments+in+molecular+approaches.">Diagnosis of bloodstream infections from positive blood cultures and directly from blood samples: recent developments in molecular approaches.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 24 (9), 944-955 (2018).</li><li>Aminov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+antibiotics+and+antibiotic+resistance+in+nature.">The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature.</a> Environmental Microbiology. 11 (12), 2970-2988 (2009).</li><li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+resistance+worldwide:+causes,+challenges+and+responses.">Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses.</a> Nature Medicine. 10 (12), 122-129 (2004).</li><li>Roca, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+threat+of+antimicrobial+resistance:+science+for+intervention.">The global threat of antimicrobial resistance: science for intervention.</a> New Microbes and New Infections. 6, 22-29 (2015).</li><li>O'Neill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+review+on+antimicrobial+resistance.+Tackling+drug-resistant+infections+globally:+final+report+and+recommendations.">The review on antimicrobial resistance. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations.</a> Wellcome Trust. , (2016).</li><li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistome:+what's+new.">The antibiotic resistome: what's new.</a> Current Opinion in Microbiology. 21, 45-50 (2014).</li><li>Piddock, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assess+drug-resistance+phenotypes,+not+just+genotypes.">Assess drug-resistance phenotypes, not just genotypes.</a> Nature Microbiology. 1 (8), 16120 (2016).</li><li>Naumann, D., Helm, D., Labischinski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+characterizations+by+FT-IR+spectroscopy.">Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy.</a> Nature. 351 (6321), 81-82 (1991).</li><li>Zarnowiec, P., Lechowicz, L., Czerwonka, G., Kaca, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourier+Transform+Infrared+Spectroscopy+(FTIR)+as+a+tool+for+the+identification+and+differentiation+of+pathogenic+bacteria.">Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) as a tool for the identification and differentiation of pathogenic bacteria.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (14), 1710-1718 (2015).</li><li>Quintelas, C., Ferreira, E. C., Lopes, J. A., Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+evolution+of+infrared+spectroscopy+applied+to+bacterial+typing.">An overview of the evolution of infrared spectroscopy applied to bacterial typing.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700449 (2018).</li><li>San-Blas, E., Cubill&#225;n, N., Guerra, M., Portillo, E., Esteves, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+xenorhabdus+and+photorhabdus+bacteria+by+Fourier+transform+mid-infrared+spectroscopy+with+attenuated+total+reflection+(FT-IR/ATR).">Characterization of xenorhabdus and photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR).</a> Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 93, 58-62 (2012).</li><li>Sousa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+the+acinetobacter+calcoaceticus-acinetobacter+baumannii+complex+species+by+Fourier+transform+infrared+spectroscopy.">Discrimination of the acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex species by Fourier transform infrared spectroscopy.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 33 (8), 1345-1353 (2014).</li><li>Rodriguez-Saona, L. E., Khambaty, F. M., Fry, F. S., Calvey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+identification+of+bacterial+strains+by+Fourier+transform+near-infrared+spectroscopy.">Rapid detection and identification of bacterial strains by Fourier transform near-infrared spectroscopy.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49 (2), 574-579 (2001).</li><li>Dawson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+Fourier+transform+infrared+spectroscopy+for+the+rapid+typing+of+uropathogenic+Escherichia+coli.">Implementation of Fourier transform infrared spectroscopy for the rapid typing of uropathogenic Escherichia coli.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 33 (6), 983-988 (2014).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Antimicrobial+Resistance-Related+Changes+in+Biochemical+Composition+of+Staphylococcus+aureus+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy-Infrared+Spectroscopy.">Detection of Antimicrobial Resistance-Related Changes in Biochemical Composition of Staphylococcus aureus by Means of Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15397-15403 (2019).</li><li>Dazzi, A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-IR:+Technology+and+Applications+in+Nanoscale+Infrared+Spectroscopy+and+Chemical+Imaging.">AFM-IR: Technology and Applications in Nanoscale Infrared Spectroscopy and Chemical Imaging.</a> Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).</li><li>Dazzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-IR:+combining+atomic+force+microscopy+and+infrared+spectroscopy+for+nanoscale+chemical+characterization.">AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization.</a> Applied Spectroscopy. 66 (12), 1365-1384 (2012).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 15 (140), (2018).</li><li>Katzenmeyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-infrared+spectroscopy+beyond+the+diffraction+limit+via+direct+measurement+of+the+photothermal+effect.">Mid-infrared spectroscopy beyond the diffraction limit via direct measurement of the photothermal effect.</a> Nanoscale. 7 (42), 17637-17641 (2015).</li><li>. Bruker Life Science Applications Available from: <a target="_blank" href="https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html">https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html</a> (2020)</li><li>Mayet, C., Dazzi, A., Prazeres, R., Ortega, J. M., Jaillard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+and+imaging+of+bacterial+polymer+nanogranules+by+infrared+nanospectroscopy.">In situ identification and imaging of bacterial polymer nanogranules by infrared nanospectroscopy.</a> Analyst. 135 (10), 2540-2545 (2010).</li><li>Baldassarre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+amide+I+absorption+in+single+bacteria+and+mammalian+cells+with+resonant+infrared+nanospectroscopy.">Mapping the amide I absorption in single bacteria and mammalian cells with resonant infrared nanospectroscopy.</a> Nanotechnology. 27 (7), 075101 (2016).</li><li>Vitry, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+infrared+and+mode+synthesizing+atomic+force+microscopy:+Application+to+the+study+of+lipid+vesicles+inside+Streptomyces+bacteria.">Combining infrared and mode synthesizing atomic force microscopy: Application to the study of lipid vesicles inside Streptomyces bacteria.</a> Nano Research. 9 (6), 1674-1681 (2016).</li><li>Dazzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+mapping+of+the+distribution+of+viruses+into+infected+bacteria+with+a+photothermal+method.">Chemical mapping of the distribution of viruses into infected bacteria with a photothermal method.</a> Ultramicroscopy. 108 (7), 635-641 (2008).</li><li>Steenbergen, J. N., Alder, J., Thorne, G. M., Tally, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daptomycin:+a+lipopeptide+antibiotic+for+the+treatment+of+serious+Gram-positive+infections.">Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the treatment of serious Gram-positive infections.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 283-288 (2005).</li><li>Garcia, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MacFarlan+Standards.">MacFarlan Standards.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition. , (2010).</li><li>NanolR-2 System Manual. Anasys Instruments Available from: <a target="_blank" href="https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf">https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf</a> (2020)</li><li>Whelan, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+an+en+masse+and+reversible+B-+to+A-DNA+conformational+transition+in+prokaryotes+in+response+to+desiccation.">Detection of an en masse and reversible B- to A-DNA conformational transition in prokaryotes in response to desiccation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (97), 20140454 (2014).</li><li>McGuinness, W. A., Malachowa, N., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vancomycin+Resistance+in+Staphylococcus+aureus.">Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (2), 269-281 (2017).</li><li>Howden, B. P., Peleg, A. Y., Stinear, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+vancomycin+intermediate+Staphylococcus+aureus+(VISA)+and+heterogenous-VISA.">The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA.</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 21, 575-582 (2014).</li><li>Perez-Guaita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Atomic+Force+Microscopy-Infrared+Nano-Imaging+of+Malaria+Infected+Red+Blood+Cells.">Multispectral Atomic Force Microscopy-Infrared Nano-Imaging of Malaria Infected Red Blood Cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3140-3148 (2018).</li></ol>

Gostaríamos de reconhecer Bruker pelo pagamento da taxa de publicação. KK, BRW, AP e PH são inventores de uma patente internacional (PCTIB2020/052339), que descreve alguns dos aspectos fundamentais da abordagem.

A utilidade da espectroscopia de RI para caracterização de uma ampla gama de amostras biológicas no contexto de sua composição química é bem estabelecida. Na última década, a espectroscopia de RI surgiu como uma ferramenta promissora para estudos bacterianos12,13,14,15,16,17. Continua a atrair interesse substancial no campo da microbiologia, como uma das poucas técnicas que permitem uma caracterização fenotípica através da composição química. Nesse contexto, a maior desvantagem da microscopia FTIR convencional está na resolução espacial limitada, prevenindo estudos unicelulares e subcelulares de bactérias. Na verdade, o pequeno tamanho das bactérias representa um impedimento não só para o IR, mas para a grande maioria das técnicas. Assim, as ferramentas de pesquisa disponíveis para estudos unicelulares e subcelulares de bactérias são significativamente limitadas. A combinação de AFM com IR permite que a limitação de resolução espacial da espectroscopia de RI seja superada, fornecendo uma nova ferramenta para a pesquisa bacteriana, capaz de sondar nanoescala da composição química.
A técnica não se limita a estudos de células únicas e permite sondar uma variedade de amostras, variando em espessura. Sem dúvida, a preparação de amostras limpas e cuidadosas é fundamental para alcançar imagens de alta qualidade. O protocolo aqui fornece um método para preparar amostras de multicamadas, monocamadas e/ou células únicas de várias bactérias(Figura 1). A amostra preparada depende de vários fatores, incluindo a carga bacteriana inicial, diluição pós-lavagem, bem como diluição adicional no substrato. A quantidade de amostra obtida após a diluição das pelotas lavadas e antes da deposição no substrato normalmente permite a preparação de inúmeras amostras. Portanto, para obter a distribuição desejada da amostra no substrato, muitas vezes é benéfico preparar uma série de amostras, variando em sua diluição. Para estudos que visam a coleta de espectros AFM-IR em vez de imagens subcelulares, modificar a quantidade de amostra (por exemplo, de monocamada para multicamadas) pode ser benéfico para aumentar a intensidade do sinal.
Outro aspecto crítico na preparação da amostra é a remoção adequada de resíduos médios. Dependendo dos métodos de cultivo de amostra selecionados, a amostra é coletada a partir do meio líquido ou de uma placa de ágar. Em ambos os casos, é provável que o residual médio esteja presente na amostra, embora em menor grau após a coleta de placas de ágar. Como as mídias de crescimento bacteriana contêm uma abundância de vários componentes biológicos, é fundamental garantir a remoção adequada do meio. Recomendamos três lavagens com água ultrauso para amostras de ágar e pelo menos quatro lavagens para amostras coletadas de médio porte. O número de lavagens pode ser aumentado, se necessário; no entanto, para comparação entre várias amostras, é importante mantê-la consistente entre as amostras. O protocolo demonstrado utiliza água, em vez de solventes como solução tampão fosfato (PBS) ou soro fisiológico. Tanto a PBS quanto a solução salina levam à formação de cristais na secagem do ar, o que pode danificar as bactérias. Além disso, ambas são fonte de intensas bandas de IR, com PBS, em particular, contendo múltiplas bandas na região das impressões digitais. A falta de capacidade para o uso de soro fisiológico ou PBS, atualmente representa uma limitação importante para a técnica. Normalmente, o uso de água para lavagem não causa qualquer influência destrutiva sobre as bactérias; no entanto, deve-se tomar cuidado e, se possível, o tempo de exposição à água deve ser limitado. Se o protocolo de preparação da amostra precisar ser pausado na fase de lavagem, recomenda-se deixar a amostra em forma pelletizada após a remoção da água. Isso é de particular importância para as bactérias Gram-negativas, contendo uma parede celular mais fina, pois elas são mais propensas à ruptura.
Para garantir dados AFM-IR adequados e de alta qualidade, vários aspectos do protocolo de coleta de dados são de fundamental importância. Em primeiro lugar, a coleta correta de fundo é essencial para a aquisição de dados. Em particular, é necessária a manutenção dos níveis estáveis de umidade em todo o conjunto de dados, bem como entre o fundo e a coleta de amostras. Para garantir isso, recomendamos a purga do instrumento com nitrogênio e a manutenção dos níveis de umidade não superiores a 25%. A falta de purga pode impor uma limitação significativa, particularmente em locais com alta umidade. Em segundo lugar, destaca-se a importância da otimização adequada das manchas de IR. Para obter melhores resultados, o conhecimento a priori sobre a posição da banda maxima pode ser benéfico. Por exemplo, um espectro de IR convencional de pelotas bacterianas pode ser usado para determinar posições de bandas esperadas a partir de uma amostra. Se isso não for possível adquirir, como abordagem alternativa, o usuário pode utilizar espectros de RI disponíveis na literatura ou iniciar a otimização usando uma posição de banda que é razoável esperar na bactéria (por exemplo, amide I e amide II). Em terceiro lugar, para a coleta de dados, é importante destacar a significância da seleção cuidadosa de energia (permitindo alcançar uma boa relação S/N), pois pode ter um efeito destrutivo. O poder aconselhado depende da espessura da amostra, com orientação áspera disponível no manual do instrumento31. Recomendamos testar empiricamente o estado da amostra pós-medição por coleta de uma imagem AFM, pois revelará qualquer influência destrutiva. Além disso, a coleta de imagens AFM da mesma área antes e depois da coleta de espectros AFM-IR serve como uma boa confirmação de que não ocorreu nenhuma deriva e o espectro de fato se origina do ponto selecionado na célula. A possibilidade de deriva é particularmente importante na aplicação da modalidade de imagem, por meio de imagens consecutivas de intensidade de IR em valores de número de ondas selecionados. Um exemplo disso é ilustrado na Figura 5. A área imagem foi definida no início do experimento e deve ser consistente para todos os valores do número de ondas. No entanto, uma deriva clara é visível entre cada imagem de altura AFM (e a intensidade de número de onda ir correspondente), com tempo de aquisição de cada mapa de aproximadamente 40 minutos. Devido a isso, para usuários que coletam dados de imagem, recomendamos sempre selecionar uma área ligeiramente maior que a amostra de interesse, para garantir que, mesmo após a existência de deriva, a amostra de interesse permanecerá dentro da área de imagem.
As limitações potenciais do protocolo incluem a falta de capacidade de coleta de dados em estado hidratado em soluções fisiológicas (por exemplo, soro fisiológico ou PBS) descritas acima. Além disso, especialmente em áreas de alta umidade, muitas vezes há necessidade de expurgo de nitrogênio. Além disso, o protocolo permite sondar organismos até 100 nm de tamanho, excluindo a possibilidade de seu uso para estruturas menores. Embora isso possa ser superado usando um laser diferente (por exemplo, laser em cascata quântica permitindo alcançar a resolução espacial de 20 nm), ele também está associado com alcance espectral limitado, bem como dificuldades em obter uma boa relação sinal-ruído. Finalmente, a sondagem de superfícies macias pode apresentar um desafio com a ponta não detectando a superfície corretamente e procedendo além do ponto de contato, até a quebra. Embora isso normalmente não seja um problema com amostras bacterianas, pode ocorrer após medições de amostras mais suaves. Nesses casos, recomenda-se tentar se engajar na superfície limpa do substrato nas proximidades da amostra.
O protocolo descrito pode ser utilizado para inúmeros tipos de pesquisas bacterianas, incluindo estudos comparativos entre várias amostras, bem como exame subcelular. Os dados podem ser analisados utilizando abordagens quimiómétricas para as modalidades de espectro único e imagem35,dependendo do objetivo da pesquisa. Além disso, o protocolo também pode ser modificado para aplicação a outros materiais biológicos (como fungos, leveduras, células, etc.), através da adição de fixação.

Bactérias são organismos procarióticos de células únicas, ocorrendo em várias formas e tamanhos, tipicamente na faixa de várias centenas de nanômetros a micrômetros. Eles existem em uma variedade de habitats e são essenciais para a existência da vida. Dentro do corpo humano, a maioria das bactérias presentes no intestino são inofensivas e muitas são de fato benéficas1. No entanto, várias espécies bacterianas são patogênicas e causam uma série de doenças infecciosas. Infecções bacterianas podem levar ao desenvolvimento de sepse e choque séptico: uma condição de risco de vida, resultante da resposta do corpo a uma infecção2. A sepse é uma grande ameaça à saúde global, com alta prevalência mundial e taxas de mortalidade severas. Somente em 2017, foram registrados cerca de 50 milhões de casos de sepse em todo o mundo, com 11 milhões deles resultando em morte (aproximadamente 20%)2. Além disso, a diminuição das chances de sobrevivência do paciente, devido à demora terapêutica, mostrou-se ocorrer de forma horária3,4.
Infecções bacterianas são tratadas com antibióticos. A gravidade das consequências potenciais das infecções bacterianas da corrente sanguínea (ISS), juntamente com um claro significado do início rápido da terapia antimicrobiana, estimula a necessidade de administração imediata de antibióticos. No entanto, como as abordagens diagnósticas atuais utilizadas na prática clínica (por exemplo, cultivo de sangue) requerem um tempo relativamente longo, a administração de antibióticos geralmente ocorre antes do diagnóstico positivo do BSI5. Esse fator leva ao uso excessivo de antibióticos, o que, juntamente com o uso excessivo de antibióticos em outros setores, como a agricultura, cria uma severa pressão evolutiva para o desenvolvimento da resistência antimicrobiana (AMR)6,7. Atualmente, a AMR é um dos mais urgentes problemas globais de saúde7,8 e, até 2050, está prevista para se tornar a principal causa de morte9. O desenvolvimento da resistência, juntamente com a disseminação das cepas de AMR está ocorrendo em um ritmo alarmante7,8,9 e excede, de longe, a taxa de descoberta de novos antibióticos10. Novos fenótipos resistentes estão continuamente emergindo em todo o mundo, enquanto pesquisa dedicada à compreensão das alterações relacionadas à RM é muitas vezes lenta e limitada pelas abordagens disponíveis11. Além disso, os métodos comumente utilizados, como a reação em cadeia de polimerase (PCR) e o sequenciamento genético inteiro (WGS), focam apenas em alterações genotipópicas. Estes não são suficientes para revelar os mecanismos de resistência11, o que provoca uma necessidade urgente de uma ferramenta de pesquisa que permita compreender a composição química das bactérias.
A espectroscopia infravermelha (IR) fornece uma caracterização molecular da amostra e, portanto, é um candidato promissor para sondagem bacteriana fenotípica. Desde suas primeiras aplicações12, uma grande magnitude de exemplos de seu uso foi demonstrada na literatura13,14. Estes incluem a identificação à base de bactérias emgêneros 15, espécies16e cepa17,18 nível. No entanto, a resolução espacial do IR convencional é restrita a vários mícrons devido ao limite de resolução espacial de difração de difração de comprimento de onda19. Uma vez que o tamanho da maioria das bactérias está abaixo desse limite (por exemplo, Staphylococcus aureus ≈ 400 nm de diâmetro), o IR convencional não é aplicável para sondagem no nível unicelular ou intracelular.
A limitação da resolução espacial foi recentemente superada pela combinação de espectroscopia de IR com Microscopia da Força Atômica (AFM-IR). Neste caso, a absorção do IR é detectada indiretamente, através da expansão térmica do material19,20,21,22. Em suma, a absorção da radiação IR resulta em um aumento de temperatura local. Isso pode ser medido diretamente23 ou através da medição da oscilação da sonda cantilever AFM, resultante do impulso de força criado pela absorção de IR20,21. A técnica combinatória AFM-IR permite alcançar uma resolução espacial de 20 nm, fornecendo informações simultâneas sobre as propriedades físicas locais de uma amostra (AFM) e sua composição química (AFM-IR). A coleta de ambos, espectro único de pontos selecionados e mapeamento da intensidade dos valores de número de ondas selecionados dentro de uma área escolhida são possíveis.
Considerando a resolução espacial alcançável do AFM-IR, é evidente que a técnica abre a possibilidade de sondagem química/fenotípica de célula única de bactéria e sua composição intracelular24. Até então, vários exemplos da aplicação de AFM-IR para bactérias únicas foram demonstrados na literatura19,20,21,22,25,26,27,28. Estes envolvem análise espectral única19,21,22 e mapeamento no nível subcelular19,22,25,26,27,28. Por exemplo, a capacidade de detectar vesículas lipídicas intracelulares27 e vírus28 dentro de uma única bactéria foi descrita. Esses resultados demonstram a utilidade do AFM-IR para estudos de nanoescala de bactérias únicas e patógenos clinicamente relevantes19.
Assim, apresentamos um método de preparação e coleta de amostras para dados AFM-IR de amostras bacterianas multicamadas, monocamadas e células únicas. O protocolo aqui descrito foi aplicado para estudar diferentes espécies de bactérias22 e as alterações em sua composição química. Em particular, o desenvolvimento in vivo da resistência à vancomicina e da suscetibilidade à daptomicina foi investigado em pares clínicos de S. aureus19. Ambos, a resistência intermitente vancomicina e a não suscetibilidade à daptomicina em S. aureus (VISA e DpR) surgiram relativamente recentemente, após o aumento do uso e introdução desses antibióticos às clínicas, constituindo um problema médico significativo. Além disso, em particular, o mecanismo de não suscetibilidade da daptomicina ainda permanece indescritível, impedindo o desenvolvimento de medicamentos alternativos19,29. O protocolo apresentado se concentra no fornecimento de espectros afm-IR confiáveis de bactérias únicas, que podem ser analisados ainda utilizando uma variedade de abordagens quimiómétricas, de acordo com os objetivos experimentais. Além disso, inclui a abordagem de mapeamento, que é aplicável para estudos intracelulares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM metal specimen disc</td>
			<td>PST ProSciTech Pty Ltd</td>
			<td>GA530-15</td>
			<td>Recommended 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anasys AFM-IR nanoIR2</td>
			<td>Anaysys Instruments</td>
			<td>0</td>
			<td>model: nanoIR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2</td>
			<td>Bruker / Anasys Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Model: Model: PR-EX-NIR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td>-</td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Heathrow Scientific&#160;</td>
			<td>HEA4323</td>
			<td>Can be replaced with any other micro-centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoIR 2 instrument</td>
			<td>Bruker / Anasys Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLS toolbox</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td>-</td>
			<td>GUI for Matlab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PP2001</td>
			<td>Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selected bacterial strain</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate (e.g. Raman grade CaF2)</td>
			<td>Crystran</td>
			<td>CAFP13-2R</td>
			<td>Recommended size: 13 mm &#216; x 2.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-C</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 0.5-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy combined with infrared spectroscopy as a tool to probe single bacterium chemistry

A Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) é uma nova técnica combinatória, que permite a caracterização simultânea de propriedades físicas e composição química da amostra com resolução nanoescala. Ao combinar AFM com IR, a limitação de resolução espacial do IR convencional é superada, permitindo que uma resolução de 20-100 nm seja alcançada. Isso abre as portas para uma ampla gama de novas aplicações de IR para sondar amostras menores que vários micrômetros, antes inalcançáveis por meio de microscopia de RI convencional. O AFM-IR é eminentemente adequado para pesquisas bacterianas, fornecendo informações espectrais e espaciais no nível único e intracelular. As crescentes preocupações globais com a saúde e a previsão futura desfavorável em relação às infecções bacterianas e, especialmente, ao rápido desenvolvimento da resistência antimicrobiana, criaram uma necessidade urgente de uma ferramenta de pesquisa capaz de sondar fenotípico no nível único celular e subcelular. A AFM-IR oferece o potencial de atender a essa necessidade, permitindo a caracterização detalhada da composição química de uma única bactéria. Aqui, fornecemos um protocolo completo para preparação amostral e aquisição de dados de espectro único e modalidade de mapeamento, para a aplicação do AFM-IR em estudos bacterianos.

O protocolo descrito permite obter uma gama de tipos de distribuições celulares de bactérias no substrato, dependendo da concentração inicial da amostra e da quantidade de água adicionada. A Figura 1 ilustra os exemplos de imagens AFM (altura e deflexão) registradas a partir de monocamadas e amostras de células únicas preparadas usando o protocolo descrito das bactérias Gram-positive(S. aureus) e Gram-negativas(Escherichia coli).
O protocolo descrito aqui pode ser utilizado para imagens AFM-IR de estruturas intra e extracelulares de bactérias únicas. Um exemplo desta aplicação é mostrado na Figura 2,que demonstra os resultados do monitoramento das alterações químicas espacialmente localizadas ocorridas durante a divisão de uma célula S. aureus. Embora a secagem do ar seja comumente considerada como uma abordagem de fixação para a preparação bacteriana, as bactérias, por natureza, mostram resistência muito alta a fatores externos, como a temperatura e foram relatadas para sobreviver à desidratação32. Os resultados aqui apresentados foram adquiridos a partir de uma amostra seca de ar. A formação de um septo, ocorrida antes da divisão celular foi observada e monitorada via imagem AFM (Figura 2A-D) por coleta de 12 imagens da mesma área consecutivamente (coleta de uma única imagem ≈ 20 min). A Figura 2A-D mostra 4 imagens AFM selecionadas, com tempo entre a coleta de cada imagem de aproximadamente 40 minutos. A estrutura formada (septo) tem 45 nm de altura. O septo formado é claramente visível em imagens de altura e deflexão da AFM(Figura 2E-F). Os espectros AFM-IR registrados a partir da área celular e septo (Figura 2G, pontos de origem marcados na Figura 2F) foram normalizados para a faixa amida I antes da comparação, para minimalizar a influência da espessura amostral variada entre os pontos de coleta de dados. O espectro AFM-IR do septo é caracterizado por maior intensidade relativa das bandas em 1240 e 1090 cm-1 em comparação com o espectro AFM-IR coletado da área celular. Estes são atribuídos a grupos de carboidratos e fosfodiester de componentes da parede celular (incluindo, por exemplo, peptidoglycan e ácido teicóico)22.
O protocolo descrito também pode ser usado para comparação de um único espectro entre várias amostras diferentes. Um exemplo deste aplicativo juntamente com os resultados é mostrado na Figura 3 e Figura 4. O objetivo do estudo é determinar as alterações químicas ocorridas como resultado do desenvolvimento in vivo da resistência intermitente vancomicina em S. aureus (VISA). Para isso, foram coletados pares clínicos de amostras dos pacientes, com a cepa dos pais isolada após a internação no hospital e antes da terapia antibiótica (vancomicina suscetível S. aureus, VSSA) e a cepa da filha isolada do mesmo paciente após a admissão de antibióticos e insuficiência clínica. As amostras foram ainda cultivadas em ágar médio e preparadas de acordo com o protocolo (Figura 3A-B). Os espectros AFM-IR foram coletados de múltiplas bactérias únicas (e múltiplas amostras) para VSSA e VISA e posteriormente analisados utilizando várias abordagens quimiométricas(Figura 3C).
Não foram observadas diferenças morfológicas entre as células VSSA e VISA(Figura 4A-C). No entanto, os espectros AFM-IR (Figura 4D,F) e seus segundo derivados (Figura 4E,G) demonstraram uma clara diferença na composição química entre cepas resistentes e suscetíveis. A intensidade relativa das bandas associadas aos grupos de carboidratos e fosfodiester a partir de componentes da parede celular (em particular, a banda em 1088 cm-1) claramente aumentou na cepa resistente, em comparação com a contrapartida suscetível. Nota-se que todos os espectros recodificados (VISA: 81, VSSA: 88) mostram um pequeno desvio padrão. Isso demonstra boa reprodutibilidade de dados registrados a partir de várias amostras preparadas a partir da mesma cepa, uma vez que não foi possível discriminação entre espectros registrados de diferentes amostras da mesma cepa. As diferenças observadas indicaram um aumento da espessura da parede celular em cepas resistentes, em comparação com a contrapartida suscetível, que permanece de acordo com outros relatórios de literatura33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig01.jpg"> Figura 1: Imagens representantes da AFM de várias amostras bacterianas para medições AFM-IR. Dependendo da diluição do substrato, o protocolo permite obter multicamadas e monocamadas de bactérias, bem como amostras unicelulares. Imagens de REPRESENTANTE AFM de: (A-D) monocamada e (E-H) amostra de célula única para (A, B,E,F) Gram-positivo(S. aureus) e (C,D,G,H) Gram negativo(E. coli). (A,C,E,G) demonstram imagens de altura e (B,D,F,H) mostram imagens de deflexão correspondentes. Tamanho das áreas imagens: (A-D,G,H) 20 x 20 μm, (E,F) 50 x 50 μm. (I–K) seleção consecutiva de uma área para mapeamento AFM-IR. Isso é conseguido usando imagens AFM com resolução espacial crescente no exemplo de uma única célula S. aureus. Cada imagem é coletada por amostragem de 200 x 200 pontos, com aumento da resolução espacial devido à redução do tamanho da área imagem. Tamanho das áreas de imagem: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm e (K) 2,24 x 2,24 μm. O quadrado preto em(I) marca a área imagem em(J). O quadrado preto em (J) marca a área imagem em(K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig02.jpg"> Figura 2: Monitorando a divisão celular S. aureus via AFM-IR. (A-D) Imagens AFM da célula S. aureus mostrando a formação de septo anterior à divisão celular. Tamanho da área de imagem: 2 x 2 μm. As imagens foram selecionadas a partir de uma série maior (12 imagens gravadas a cada 20 minutos) e representam dados registrados a cada 40 minutos. (E-F) imagem de altura e deflexão AFM registrada no final da formação de septo celular com pontos marcados de coleta de espectros AFM-IR. Tamanho da área de imagem 1,17 x 1,15 μm. A altura da estrutura recém-formada é de 45 nm. (G) Espectros AFM-IR registrados a partir da área celular (preta) e septo (vermelho) (marcado em (F)), na faixa 1400-900 cm-1. Ambos os espectros foram normalizados para a banda amide I e demonstram um aumento na intensidade relativa dos componentes da parede celular a partir do septo. Este número foi modificado de K. Kochan et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig03.jpg"> Figura 3: Uma visão geral do projeto experimental para o estudo AFM-IR de resistência antimicrobiana. (A) Origem da amostra e preparação inicial: a cepa parental suscetível foi coletada de um paciente antes da terapia antibiótica e a cepa resistente à filha foi originada do mesmo paciente após a antibióticoterapia e falha clínica (desenvolvimento de resistência in vivo). As bactérias foram isoladas e cultivadas no ágar de Infusão cardíaca (HI) por 16 h em 37 °C. (B) Preparação posterior da amostra para AFM-IR, incluindo coleta da amostra seguida de lavagem de palete bacteriana (3×) e deposição amostral. (C) Coleta e análise de dados AFM-IR: altura AFM e espectro AFM-IR (1800-900 cm-1). Tamanho da área de imagem AFM: 1,7 x 1,4 μm. O espectro AFM-IR foi coletado do meio da célula. Os dados foram posteriormente analisados utilizando-se abordagens quimiómétricas, incluindo análise hierárquica de cluster. Este número foi modificado de K. Kochan et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig04.jpg"> Figura 4: Resultados afm e AFM-IR do estudo de alterações químicas na vancomicina intermediária S. aureus (VISA) em comparação com vancomicina suscetível S. aureus (VSSA) em pares clínicos. Imagens AFM de(A-B) AMOSTRAS DE VISA e(C) VSSA de célula única. Tamanho das áreas imagens: (A,C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D-E) Espectro médio AFM-IR e seus(F-G) segundo derivados para: (D,F) VISA e(E,G) Células VSSA, na faixa espectral 1800-900 cm-1. Os espectros apresentados são uma média de 81 (VISA) e 88 (VSSA) espectros individuais e são apresentados juntamente com desvio padrão (SD). A média foi realizada após a normalização de todos os espectros individuais juntos. As principais bandas estão marcadas em (F-G). Este número foi modificado de K. Kochan et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig05.jpg"> Figura 5: A imagem deriva sobre o registro consecutivo de mapas AFM-IR em valores de número de ondas selecionados para a célula S. aureus. (Linha superior): as imagens AFM foram registradas simultaneamente com os mapas AFM-IR correspondentes com base na intensidade do sinal IR em valores de número de ondas selecionados. Os valores do número de ondas (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm-1) estão anotados acima da linha inferior. Cada conjunto (imagem AFM e mapa AFM-IR) foi gravado logo após a imagem anterior (aproximadamente 40 minutos por conjunto). O tamanho da área imagem/mapeada: 1,54 x 1,57 μm. Uma deriva clara é visível entre as imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry at JoVE.com

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

A Espectroscopia De Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) fornece uma plataforma poderosa para estudos bacterianos, permitindo alcançar a resolução de nanoescala. Ambos, o mapeamento de alterações subcelulares (por exemplo, na divisão celular) quanto estudos comparativos de composição química (por exemplo, decorrentes da resistência a medicamentos) podem ser conduzidos a um único nível celular em bactérias.

Microscopia da Força Atômica Combinada com Espectroscopia Infravermelha como ferramenta para sondar química de bacterium único

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

atomic-force-microscopy-combined-with-infrared-spectroscopy-as-tool

Research

JoVE Journal

Chemistry

3.7K visualizações.  Monash University. A Espectroscopia De Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) fornece uma plataforma poderosa para estudos bacterianos, permitindo alcançar a resolução de nanoescala. Ambos, o mapeamento de alterações subcelulares (por exemplo, na divisão celular) quanto estudos comparativos de composição química (por exemplo, decorrentes da resistência a medicamentos) podem ser conduzidos a um único nível celular em bactérias.

Vídeo: Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Química

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

Espectroscopia de RMN como uma ferramenta robusta para a avaliação rápida do perfil lipídico do óleo de peixes suplementa

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Coulomb Explosion Imaging as a Tool to Distinguish Between Stereoisomers

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish between enantiomers (stereoisomers) of simple chiral species on the level of individual molecules. In this approach, a gaseous molecular jet of the sample expands into a vacuum chamber and intersects with femtosecond (fs) laser pulses. The high intensity of the pulses leads to fast multiple ionization, igniting a so-called Coulomb Explosion that produces several cationic (positively charged) fragments. An electrostatic field guides these cations onto time- and position-sensitive detectors. Similar to a time-of-flight mass spectrometer, the arrival time of each ion yields information on its mass. As a surplus, the electrostatic field is adjusted in a way that the emission direction and the kinetic energy after fragmentation lead to variations in the time-of-flight and in the impact position on the detector.
Each ion impact creates an electronic signal in the detector; this signal is treated by high-frequency electronics and recorded event by event by a computer. The registered data correspond to the impact times and positions. With these data, the energy and the emission direction of each fragment can be calculated. These values are related to structural properties of the molecule under investigation, i.e. to the bond lengths and relative positions of the atoms, allowing to determine molecule by molecule the handedness of simple chiral species and other isomeric features.

For small chiral species, Coulomb Explosion Imaging provides a new approach to determine the handedness of individual molecules.

Imagens de Explosão de Coulomb como uma Ferramenta para Distinguir Estereoisômeros

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

Espectroscopia de impedância eletroquímica como uma ferramenta para estimativa de constante taxa eletroquímica

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using visible-range light. The purpose of this protocol is to detail a proven method for preparing plasmonic nanoparticle samples and performing single particle spectroscopy on them with DIC microscopy. Several important steps must be followed carefully in order to perform repeatable spectroscopy experiments. First, landmarks can be etched into the sample substrate, which aids in locating the sample surface and in tracking the region of interest during experiments. Next, the substrate must be properly cleaned of debris and contaminants that can otherwise hinder or obscure examination of the sample. Once a sample is properly prepared, the optical path of the microscope must be aligned, using Kohler Illumination. With a standard Nomarski style DIC microscope, rotation of the sample may be necessary, particularly when the plasmonic nanoparticles exhibit orientation-dependent optical properties. Because DIC microscopy has two inherent orthogonal polarization fields, the wavelength-dependent DIC contrast pattern reveals the orientation of rod-shaped plasmonic nanoparticles. Finally, data acquisition and data analyses must be carefully performed. It is common to represent DIC-based spectroscopy data as a contrast value, but it is also possible to present it as intensity data. In this demonstration of DIC for single particle spectroscopy, the focus is on spherical and rod-shaped gold nanoparticles.

The goal of this protocol is to detail a proven approach for the preparation of plasmonic nanoparticle samples and for performing single particle spectroscopy on them with differential interference contrast (DIC) microscopy.

Realização de espectroscopia em nanopartículas Plasmonicas com microscopia de contraste de interferência diferencial de tipo Nomarski baseado em transmissão

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids with adsorbates. Vibrational spectra provide information on the chemical nature of adsorbed species and their structure. Thus, they are very useful for obtaining molecular level understanding of surface species. The IR spectrum of the sample itself gives some direct information about the material. General conclusions can be drawn concerning hydroxyl groups, some stable surface species and impurities. However, the spectrum of the sample is &#34;blind&#34; with respect to the presence of coordinatively unsaturated ions and gives rather poor information about the acidity of surface hydroxyls, species decisive for the adsorption and catalytic properties of the materials. Furthermore, no discrimination between bulk and surface species can be made. These problems are solved by the use of probe molecules, substances that interact specifically with the surface; the alteration of some spectral features of these molecules as a result of adsorption provides valuable information about the nature, properties, location, concentration, etc., of the surface sites.
The experimental protocol for in-situ IR studies of gas/sample interaction includes preparation of a sample pellet, activation of the material, initial spectral characterization through the analysis of the background spectra, characterization by probe molecules, and study of the interaction with a particular set of gas mixtures. In this paper we investigate a zirconium terephthalate metal organic framework, Zr6O4(OH)4(BDC)6 (BDC = benzene-1,4-dicarboxylate), namely UiO-66 (UiO refers to University of Oslo). The acid sites of the UiO-66 sample are determined by using CO and CD3CN as molecular probes. Furthermore, we have demonstrated that CO2 is adsorbed on basic sites exposed on dehydroxylated UiO-66. Introduction of water to the system produces hydroxyl groups acting as additional CO2 adsorption sites. As a result, CO2 adsorption capacity of the sample is strongly enhanced.

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

The use of FTIR spectroscopy for investigation of the surface properties of polycrystalline solids is described. Preparation of sample pellets, activation procedures, characterization with probe molecules and model studies of CO2 adsorption are discussed.

In situ Espectroscopia FTIR como ferramenta de investigação de gás/interação sólida: Adsorpção CO2 aprimorada em água na estrutura metal-orgânica UiO-66

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids ...

Characterizing Lewis Pairs Using Titration Coupled with In Situ Infrared Spectroscopy

Lewis acid-activation of carbonyl-containing substrates is a fundamental basis for facilitating transformations in organic chemistry. Historically, characterization of these interactions has been limited to models equivalent to stoichiometric reactions. Here, we report a method utilizing in situ infrared spectroscopy to probe the solution interactions between Lewis acids and carbonyls under synthetically relevant conditions. Using this method, we were able to identify 1:1 complexation between GaCl3 and acetone and a highly ligated complex for FeCl3 and acetone. The impact of this technique on mechanistic understanding is illustrated by application to the mechanism of Lewis acid-mediated carbonyl-olefin metathesis in which we were able to observe competitive binding interactions between substrate carbonyl and product carbonyl with the catalyst.

Here, we present a method for the observation of solution interactions between Lewis acids and bases by employing in situ infrared spectroscopy as a detector for titration under synthetically relevant conditions. By examining solution interactions, this method represents a complement to X-ray crystallography, and provides an alternative to NMR spectroscopy.

Caracterizando Lewis Pairs usando titulação juntamente com espectroscopia infravermelha in situ

Lewis acid-activation of carbonyl-containing substrates is a fundamental basis for facilitating transformations in organic chemistry. Historically, ...

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation of their functions in nature and potential human benefits (e.g., for drug discovery applications) are desired. This protocol describes the combination of genome mining (GM) and molecular networking (MN), two contemporary approaches that match gene cluster-encoded annotations in whole genome sequencing with chemical structure signatures from crude metabolic extracts. This is the first step towards the discovery of new natural entities. These concepts, when applied together, are defined here as MS-guided genome mining. In this method, the main components are previously designated (using MN), and structurally related new candidates are associated with genome sequence annotations (using GM). Combining GM and MN is a profitable strategy to target new molecule backbones or harvest metabolic profiles in order to identify analogues from already known compounds.

A mass spectrometry-guided genome mining protocol is established and described here. It is based on genome sequence information and LC-MS/MS analysis and aims to facilitate identification of molecules from complex microbial and plant extracts.

Mineração de genoma guiada por espectrometria em massa como ferramenta para descobrir novos produtos naturais

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals

In this work, we describe a protocol for a novel application of hyperspectral imaging (HSI) in the analysis of luminescent lanthanide (Ln3+)-based molecular single crystals. As representative example, we chose a single crystal of the heterodinuclear Ln-based complex [TbEu(bpm)(tfaa)6] (bpm=2,2&#8217;-bipyrimidine, tfaa&#8211; =1,1,1-trifluoroacetylacetonate) exhibiting bright visible emission under UV excitation. HSI is an emerging technique that combines 2-dimensional spatial imaging of a luminescent structure with spectral information from each pixel of the obtained image. Specifically, HSI on single crystals of the [Tb-Eu] complex provided local spectral information unveiling variation of the luminescence intensity at different points along the studied crystals. These changes were attributed to the optical anisotropy present in the crystal, which results from the different molecular packing of Ln3+ ions in each one of the directions of the crystal structure. The HSI herein described is an example of the suitability of such technique for spectro-spatial investigations of molecular materials. Yet, importantly, this protocol can be easily extended for other types of luminescent materials (such as micron-sized molecular crystals, inorganic microparticles, nanoparticles in biological tissues, or labelled cells, among others), opening many possibilities for deeper investigation of structure-property relationships. Ultimately, such investigations will provide knowledge to be leveraged into the engineering of advanced materials for a wide range of applications from bioimaging to technological applications, such as waveguides or optoelectronic devices.

Here, we present a protocol to obtain luminescent hyperspectral imaging data and to analyze optical anisotropy features of lanthanide-based single crystals using a Hyperspectral Imaging System.

Imagem hiperespectral como ferramenta para estudar anisotropia óptica em cristais únicos moleculares baseados em lantthanidas

In this work, we describe a protocol for a novel application of hyperspectral imaging (HSI) in the analysis of luminescent lanthanide (Ln3+)-based ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

Ligação covalente de moléculas únicas para espectroscopia de força baseada em AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...