Ringraziamo i colleghi dell'Agenzia svedese per la sanità pubblica, Matilda Svensson e Solomon Ghebremichael per l'assistenza fornita nel laboratorio BSL-3.
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Swedish Heart and Lung Foundation (HLF) (2019-0299 e 2019-0302 all'SB), del Consiglio svedese delle ricerche (VR) (2014-02592, 2019-01744 e 2019-04720 a SB), la Fondazione per prevenire la resistenza agli antibiotici (Resist), Karolinska Institutet Foundations e KID alla SB (finanziamento parziale dell'educazione al dottorato per Marco Loreti) dal Karolinska Institutet. ML è stato supportato dalla Swedish Children's Cancer Foundation (TJ2018-0128 e PR2019-0100).

Il sangue periferico umano proveniente da donatori di sangue anonimi sani è stato ottenuto dalla banca del sangue del Karolinska University Hospital, Huddinge, Svezia (approvazione etica Dnr 2010/603-31/4). Tutte le fasi sperimentali che coinvolgono mtb virulento vivo sono state eseguite presso il laboratorio Biosafety Level-3 (BSL-3) presso l'Agenzia per la Sanità Pubblica di Svezia (FOHM), Solna, Svezia.
1. Preparazione di mezzi, tamponi e colture batteriche
NOTA: I dettagli su tutti i reagenti e i materiali di consumo sono forniti nella tabella dei materiali.
<ol><li>Supporto completo RPMI: Supplemento RPMI 1640 con 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM L-glutammina, 10 mM HEPES e 10% siero bovino fetale inattivato termicamente (FBS). Evitare gli antibiotici nel mezzo di coltura cellulare quando si lavora con l'infezione da Mtb.</li>
	<li>Mezzo RPMI senza siero: Supplemento RPMI 1640 con 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM L-glutammina e 10 mM HEPES.</li>
	<li>Tampone di lavaggio: Preparare la salina tampone fosfato (PBS) contenente 0,05% (v/v) Tween-80.</li>
	<li>Buffer FACS: preparare PBS contenente 2,5% (v/v) FBS e 0,5 mM EDTA.</li>
	<li>Buffer di fissazione: preparare pbs contenente formaldeide al 4% a PBS. Assicurarsi che sia preparato al momento prima dell'uso, ad esempio miscelato da una soluzione stock di formaldeide al 37%.</li>
	<li>Tampone di permeabilizzazione: Aggiungere lo 0,1% di citrato di sodio e lo 0,1% di Tritone X-100 all'acqua deionizzata.</li>
	<li>Tampone di lavaggio (per immunofluorescenza): preparare PBS contenente lo 0,1% di BSA e lo 0,1% di Tween-20.</li>
	<li>Tampone di blocco: preparare pbs contenente 0,1% BSA e 10% siero di capra normale (NGS) a PBS.</li>
	<li>Tampone di colorazione (per immunofluorescenza): Preparare pbs contenente 0,1% BSA a PBS.</li>
	<li>Tb supporto completo: Supplemento Middle Brook 7H9 brodo con 0.05% (v/v) Tween-80, 0.5% (v/v) glicerolo, kanamicina (20 μg/mL), 10% (v/v) Middlebrook acido oleico, albumina, destrosio e arricchimento catalasi (Middlebrook OADC Enrichment).</li>
	<li>Colture batteriche: Utilizzare il ceppo di laboratorio standard virulento Mtb, H37Rv, che esprime in modo costitutivo proteina fluorescente verde (GFP), per l'infezione di cellule derivate da monociti. Questo ceppo mtb trasporta un plasmide pFPV2 che contiene un gene che codifica per la GFP, così come un gene per la resistenza alla kanamicina. La resistenza agli antibiotici consente la selezione continua di batteri che esprimono plasmidi in colture contenenti kanamicina. Conservare i batteri in TB mezzo completo e 70% glicerolo (diluizione 1:1) a -80 °C.</li>
</ol>2. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico dai cappotti buffy
NOTA: Eseguire tutti i lavori con sangue umano (potenzialmente contagioso) all'interno di un armadietto di biosicurezza di classe II. Inattivare gli emoderivati residui con disinfettanti per 15 minuti prima di scartare. Il sangue è stato ottenuto da volontari sani in questo caso. Questo protocollo di differenziazione dei macrofagi in vitro è stato istituito per includere 10 x 106 PBPC/donatori/pozzi isolati. Da ogni donatore, un mantello di buffy contiene circa 50 mL di una sospensione concentrata di leucociti originata da sangue intero, che normalmente fornisce 500-800 x 106 PBBC da cui è possibile recuperare circa il 10% o 50-80 x10 6 monociti.
<ol><li>Caricare 15 ml di sangue di buffy coat sopra 15 ml di mezzo gradiente di densità preparato in tubo da 50 ml. Sovrapporre lentamente il sangue sopra lo strato di gradiente di densità appoggiando la punta della pipetta alla parete del tubo.</li>
	<li>Ruotare i tubi a 600 x g per 25 minuti a temperatura ambiente (RT) con accelerazione 0 e decelerazione 0. NOTA: Chiudere attentamente i coperchi prima della centrifugazione e controllare sempre i supporti del tubo per verificarne la potenziale fuoriuscita dopo la centrifugazione.</li>
	<li>Rimuovere lo strato plasmatico superiore con una pipetta Pasteur sterile e successivamente raccogliere con cura lo strato di cellule mononucleari in un nuovo tubo da 50 ml utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Aggiungere il mezzo RPMI privo di siero al pellet PBMC per ottenere un volume finale di 50 mL. Mescolare con cura invertendo il tubo alcune volte prima della centrifugazione a 500 x g per 5 minuti a RT.</li>
	<li>Scartare attentamente il supernatante e rimescolare il pellet cellulare capovolgendo il fondo del tubo all'interno delle dita.</li>
	<li>Per rimuovere la contaminazione media del gradiente di densità dai PBMC, lavare le celle 2-3 volte con RPMI senza siero per ottenere un volume finale di 50 mL. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a RT. Lavare fino a quando il supernatante cellulare diventa trasparente.</li>
	<li>Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 20 mL di mezzo RPMI privo di siero.</li>
	<li>Contare le cellule mediante colorazione blu tripano, utilizzando manualmente un emocitometro o utilizzando un contatore di celle automatizzato. Diluire la sospensione cellulare in blu trypan in diluizione 1:2 o 1:10 mescolando il campione blu di trypan cellulare in una piastra di 96 pomp pomenti, ad esempio 50 μL + 50 μL (per il conteggio dell'emocitometro) o 10 μL + 10 μL (per il conteggio automatico delle celle) e contare le cellule per ottenere il numero di cellule vive / mL. ATTENZIONE: Il blu di trypan è tossico e deve essere scartato in uno spreco chimico separato.</li>
</ol>3. Differenziazione e polarizzazione delle cellule derivate dai monociti
NOTA: Per la differenziazione e la polarizzazione delle cellule derivate dai monociti, è stato seguito un protocollo che abbiamo precedentemente stabilito per le cellule simili a M0, M1 e M2, nonché per le cellule polarizzate completamente M1 e M225. Per semplicità, qui sono descritti solo i macrofagi M1 e M2 completamente polarizzati.
<ol><li>Utilizzare l'aderenza plastica per l'isolamento dei monociti. In breve, sementi pbmc appena isolati in una piastra di coltura a 6 pozzi ad una concentrazione appropriata, ad esempio 10 x 106 PBMC/pozzo in mezzo RPMI privo di siero da 2 mL e incubare a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo 2-3 ore, rimuovere le cellule non aderenti con una pipetta e lavare i pozzi 3 volte con un mezzo privo di siero da 1 mL. Le cellule attaccate sono monociti e comprendono circa il 10% del totale dei PBBC aggiunti al pozzo, cioè 106 monociti recuperati da 10 x 106 PBBC aggiunti per pozzo.</li>
	<li>Per la differenziazione dei macrofagi, preparare una soluzione di lavoro contenente rispettivamente 50 ng/mL GM-CSF o M-CSF per la polarizzazione del macrofago M1 e M2, aggiunta in 2 mL di mezzo completo RPMI per pozzo. Coltura delle cellule in un incubatore di CO2 al 5% in 37 °C per 3 giorni.</li>
	<li>Il giorno 3, rimuovere con cura 1 mL del mezzo di coltura cellulare dallo strato superiore di ogni pozzo e integrare le colture cellulari con 1 mL di mezzo completo RPMI fresco contenente la doppia concentrazione di M-CSF o GM-CSF per ottenere una concentrazione finale di 50 ng / mL nei pozzi. Aggiungere i fattori di crescita in una soluzione di lavoro prefazione di 100 ng/mL/pozzo.</li>
	<li>Il giorno 6, aggiungere diversi stimoli per gli ultimi 18-20 h di differenziazione cellulare per ottenere M1 completamente polarizzato e maturo (interferone-γ; IFN-γ, e lipolysaccharide; LPS (E. coli O55:B5)) o M2 (interleuchina 4; IL-4) macrofagi. Per la polarizzazione M1, preparare IFN-γ e LPS nel mezzo completo RPMI e aggiungere 50 μL per pozzo per ottenere una concentrazione finale di 50 ng/mL IFN-γ e 10 ng/mL LPS nelle colture cellulari. Per la polarizzazione M2, preparare IL-4 in RPMI mezzo completo e aggiungere 50 μL per pozzo per ottenere una concentrazione finale di 20 ng/mL nelle colture cellulari.</li>
	<li>Per la differenziazione dei macrofagi polarizzati M0, stimolare le cellule solo con M-CSF, senza ulteriori citochine (fornendo un fenotipo simile a M2)25.</li>
	<li>Controllare regolarmente la morfologia delle colture cellulari derivate dai monociti con microscopia ottica per assicurarsi che i monociti più piccoli siano differenziati in cellule macrofagi più grandi. Inoltre, monitorare le potenziali differenze morfologiche tra la polarizzazione M1 e M2, cioè le cellule M1 allungate e allungate rispetto alle cellule M2 con una forma più arrotondata25.</li>
	<li>Il giorno 7, trasferire le piastre con cellule derivate da monociti in un laboratorio BSL-3 per l'infezione da Mtb virulento.</li>
</ol>4. Preparazione delle colture mtb
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in una struttura BSL-3. Per tutti i lavori con Mtb virulento, utilizzare indumenti protettivi, protezione respiratoria e guanti resistenti all'etanolo.
<ol><li>Scongelare una fiala con 1 ml di aliquota batterica e mescolare con 9 ml di TB mezzo completo (diluizione 1:10) in un tubo filtrato a cappuccio da 50 ml. Coltura la sospensione in un incubatore a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo 24 ore, ruotare la sospensione batterica a 2.300 x g per 10 minuti e versare con cura il mezzo. Resopendare il pellet batterico con 15-20 ml di tb fresco mezzo completo in un nuovo tubo di coltura del tappo filtrato da 50 ml e incubare a 37 °C e 5% CO2. Mescolare i batteri sistemati nel tubo ogni 2-3 giorni per mantenere un apporto omogeneo di nutrienti per tutte le cellule batteriche.</li>
	<li>Dopo 7-10 giorni, mescolare correttamente le sospensioni batteriche tubazioni su e giù prima di trasferirsi in un tubo del tappo a vite da 50 ml.</li>
	<li>Aggiungere 35-40 ml di tampone di lavaggio sterile al tubo da 50 ml e ruotare la sospensione batterica a 2.300 x g per 10 min. Ripetere i passaggi di lavaggio una volta. Resuspend il pellet batterico in 1 mL di mezzo RPMI privo di siero pipettando con una micropipetta.</li>
	<li>Aggiungere altri 9 mL di mezzo RPMI privo di siero e sonicare la sospensione batterica all'interno di un armadio di biosicurezza di classe II per 5 minuti a 37 °C, per interrompere i grumi batterici. Immergere ripetutamente il tubo (3-4 volte) nel sonicatore del bagno d'acqua per garantire la massima interruzione dei grumi batterici. Misurare la densità ottica (OD) di 1 mL di sospensione batterica a 600 nm di lunghezza d'onda utilizzando uno spettrofotometro posto all'interno dell'armadio di biosicurezza. Utilizzare un supporto RPMI privo di siero per impostare il riferimento.</li>
	<li>Calcolare il numero di unità di formazione delle colonie (CFU) usando la formula: (OD+0.155)/0,161 = Y e Y x 107= Y x 106 CFU/mL, ad esempio, un valore OD 0,32 fornisce una concentrazione batterica di (0,32 + 0,155)/0,161 = 2,95, 2,95 x 107= 29,5 x 106 CFU/mL.</li>
</ol>5. Infezione da mtb di cellule derivate da monociti
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in una struttura BSL-3.
<ol><li>Resuspend il pellet batterico in mezzo RPMI privo di siero in un nuovo tubo sterile da 50 ml e regolare la concentrazione batterica finale a circa 5 x 106 CFU/mL.</li>
	<li>Rimuovere il supporto di coltura cellulare dalle 6 lastre di pozzo contenenti cellule derivate da monociti. Aggiungere 1 mL di mezzo RPMI privo di siero ad ogni pozzo. Aggiungere 1 mL di sospensione batterica per pozzo per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) 5:1, cioè 5 x 106 CFU per 106 macrofagi in 2 mL / pozzo e incubare le piastre per 4 ore in 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Dopo l'infezione, lavare le cellule 3 volte con 1 mL di tampone di lavaggio sterile per rimuovere i batteri extracellulari. Inclinare la piastra e rimuovere con cura l'intero tampone di lavaggio dagli angoli. Rimostrare le cellule derivate da monociti infetti da Mtb in 2 mL di mezzo completo RPMI senza antibiotici e procedere alla colorazione citometrica del flusso o incubare le cellule per altri 24 h (o altri punti di tempo) prima della citometria del flusso.</li>
</ol>6. Colorazione citometrica a flusso di cellule derivate da monociti infetti da Mtb
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in una struttura BSL-3. La colorazione citometrica del flusso potrebbe essere eseguita in una piastra da 96 po 'invece che in tubi.
<ol><li>Staccare le cellule infette da Mtb (e i controlli non infetti) dai pozzi nelle 6 piastre del pozzo per incubazione con 1 mL di tampone FACS per pozzo per almeno 30 minuti a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Pipettare delicatamente su e giù alcune volte per assicurarsi che le cellule siano staccate. Se possibile, confermare il distacco cellulare con la microscopia. Trasferire la sospensione cellulare da ogni pozzo a un tubo di microcentrifugo chiuso a vite e ruotare i tubi a 200 x g per 5 min. Scartare attentamente il supernatante pipettando.</li>
	<li>Lavare il pellet di cella in ogni tubo due volte con tampone FACS e ruotare le celle a 200 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Macchiare le cellule (circa 0,5 x 10da 6 a 1 x 106 celle/tubo) con circa 50 μL di anticorpi anti-umani coniugati al fluorocromo tra cui TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5)(Tabella 1)in combinazione con colorante di vitalità Zombie-UV per 30 min a 4 °C (frigorifero) al buio.</li>
	<li>Lavare le celle macchiate due volte con 400 μL di tampone FACS e far girare le cellule a 200 x g per 5 min.</li>
	<li>Fissare le celle macchiate con 200 μL di tampone di fissazione (appena preparato) per 30 minuti a RT al buio per garantire la completa inattivazione dei micobatteri.</li>
	<li>Lavare le cellule due volte con 400 μL di tampone FACS e girare a 200 x g per 5 minuti per rimuovere il buffer di correzione in eccesso.</li>
	<li>Rimescolare le celle fisse in 400 μL di tampone FACS e trasferire i campioni in nuovi tubi di microcentrifugo da 1 ml prima di esmetterli dal laboratorio BSL-3 per la citometria a flusso in BSL-2. Conservare le celle macchiate in +4 °C fino all'acquisizione del campione. NOTA: Spruzzare i tubi con etanolo al 70% prima di estenerli dal laboratorio BSL-3. La formaldeide è tossica (cancerogena) e deve essere maneggiata in un armadio di biosicurezza di classe II. Scartare i rifiuti di formaldeide in un rifiuto chimico separato.</li>
</ol>7. Acquisizione e analisi di dati citometrici a flusso di cellule derivate da monociti infetti da Mtb
NOTA: I passaggi da 7.1 a 7.2 devono essere eseguiti prima della colorazione citometrica del flusso sopra descritta. Per evitare problemi con il raggruppamento cellulare e la dissociazione dei coloranti tandem dopo la fissazione cellulare, l'acquisizione del campione di cellule infettate da Mtb e non infette viene eseguita entro 4-10 ore dopo la colorazione degli anticorpi primari.
<ol><li>Prima della colorazione citometrica del flusso sopra descritta, compensare il segnale fluorescente per ogni anticorpo coniugato a fluorocromo elencato nel pannello di colorazione (Tabella 1) utilizzando perline di compensazione (sia positive che negative).</li>
	<li>Titolare la diluizione anticorpale per la colorazione dei macrofagi umani per ottenere il segnale ottimale per ogni fluorocromo.</li>
	<li>Utilizzare celle non macchiate per determinare il livello di fluorescenza di fondo necessario per impostare il gate per la popolazione di cellule negative consentendo la visualizzazione delle celle macchiate (i macrofagi sono altamente fluorescenti auto).</li>
	<li>Acquisire un minimo di 50.000 celle/campione nel citometro di flusso utilizzando il software consigliato per l'acquisizione dei dati.</li>
	<li>Esportare i file di acquisizione dal citometro di flusso nel formato FCS (Flow Cytometry Standard) 3.1.</li>
	<li>Analizzare i file FCS nel software di analisi della citometria a flusso.</li>
	<li>Gate macrofagi in base alle loro caratteristiche di dispersione avanti e laterale (FSC e SSC) ed escludere le cellule morte dalla gating cellulare viva / morta utilizzando il colorante zombie-UV viability.</li>
	<li>Visualizzare macrofagi infetti da H37Rv-GFP nel canale FITC.</li>
	<li>Identificare la frequenza delle cellule macchiate positivamente e l'intensità geometrica media della fluorescenza (IFM) per tutti i marcatori(tabella 1).</li>
</ol>8. Colorazione dell'immunofluorescenza delle cellule derivate da monociti infetti da Mtb
NOTA: L'infezione da mtb deve essere eseguita in una struttura BSL-3.
<ol><li>Per l'immunosocinazione, sementi 2 x10 5 PBMC/pozzo in 500 μL di mezzo RPMI privo di siero in 8 scivoli a camera di pozzo per ottenere 2 x 104 monociti/pozzo. Dopo la differenziazione e la polarizzazione M1/M2 dei monociti, procedere con l'infezione da Mtb come descritto sopra. Fissare le diapositive dopo 24 ore di infezione da Mtb con tampone di fissazione per 30 min. Le diapositive fisse vengono conservate nel congelatore a -20 °C fino a ulteriori analisi.</li>
	<li>Lavare due volte le cellule derivate dai monociti con 200 μL di PBS per 10 minuti ciascuna.</li>
	<li>Permeabilizzare le cellule con 200 μL di tampone di permeabilizzazione per 5 minuti a RT.</li>
	<li>Lavare le cellule 3 volte con 200 μL di PBS per 5 minuti ciascuna.</li>
	<li>Lavare le cellule due volte con 200 μL di tampone di lavaggio per 5 minuti ciascuna.</li>
	<li>Blocca l'associazione non specifica con 200 μL di buffer di blocco per 30 minuti a RT.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi primari 1:100 nel tampone di colorazione e incubare le cellule M1 con un anticorpo CD64 non coniugato (Clone: 10.1) e le cellule M2 con un anticorpo CD163 non coniugato (policlonale) per 2 h a RT.</li>
	<li>Quindi, lavare le cellule 3 volte con 200 μL di tampone di lavaggio per 10 minuti ciascuna.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi secondari etichettati fluorescenti 1:1,000 nel tampone di colorazione e incubare le cellule M1 con un anti-topo IgG-Alexa Fluor 594 e le cellule M2 con un anti-coniglio IgG-Alexa Fluor 594 per 1 h a RT.</li>
	<li>Lavare le cellule 3 volte con tampone di lavaggio da 200 μL per 10 minuti ciascuna.</li>
	<li>Rimuovere la griglia della camera e aggiungere ~20 μL di supporto di montaggio DAPI in ogni pozzo e mettere un coverslip da 1,5 mm su ogni diapositiva.</li>
	<li>Sigillare il coverslip con uno strato di smalto per unghie.</li>
	<li>Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale con laser che emettono rispettivamente a 486 nm per l'eccitazione di GFP (canale verde), 402 nm per DAPI (blu) e 560 nm per anticorpi secondari (rosso).</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo sperimentale descrive l'effettiva polarizzazione delle cellule derivate da mieloidi in fenotipi M1 o M2, inclusa la valutazione con un pannello di citometria a flusso a 10 colori che consente la visualizzazione e la caratterizzazione profonda della Mtb con etichetta GFP in diversi sottoinsiemi di macrofagi. Sebbene la TBC sia un'antica malattia umana, attualmente non esiste un modello standard d'oro per studiare le interazioni Mtb-macrofagi, e la citometria a flusso multicolore dei macrofagi potrebbe essere complicata rispetto alle analisi delle risposte dei linfociti. Pochi protocolli disponibili per la differenziazione in vitro dei monociti umani ai macrofagi presentano una profonda conoscenza del tipo di macrofagi generati. Un protocollo di base per la polarizzazione delle macrofagi e la valutazione citometrica del flusso dell'attivazione del macrofago utilizzando un solido pannello di marcatori può probabilmente facilitare tale caratterizzazione e offrire l'opportunità di esplorare ulteriori caratteristiche delle cellule polarizzate trattate in condizioni diverse. Ciò include analisi di cellule coltivate in vitro e analisi di cellule in vivo in campioni clinici, cioè sia PBMC che sospensioni a cellule singole da fluidi corporei (cioè lavanda broncoalveolare) o tessuto omogeneizzato. Di conseguenza, la differenziazione e/o lo stato di attivazione dei monociti e dei macrofagi ottenuti dai pazienti potrebbero essere correlati all'esito della malattia. L'espansione di CD16+CD163+ monociti nel sangue periferico è stata segnalata in pazienti affetti da TBCpolmonare 30. Una maggiore frequenza di cellule CD163+ è stata rilevata anche nella pelle infiammata dei pazienti con dermatite atopica31. Allo stesso modo, i macrofagi simili a CD206+ M2 hanno dimostrato di inibire la proliferazione e la differenziazione delle cellule nel microambiente del tessuto adipocite32 e di essere arricchiti in campioni di midollo osseo da pazienti con leucemia mieloide acuta (AML)29. Un elevato rapporto tra cellule CD64 (M1) e CD163 (M2) nel sangue intero di pazienti con osteoartrite è stato trovato associato alla gravità della malattia33. Un altro studio ha utilizzato CD86 (M1) e CD163 (M2) per dimostrare che l'alta espressione M1 nei tessuti è correlata a un risultato peggiore in un sottogruppo di tumori maligni alcervello 34.
Ci sono diversi vantaggi significativi di questo protocollo sperimentale di citometria a flusso M1/M2. Questo modello offre l'opportunità di studiare risposte immunitarie innate all'infezione virulente della Mtb e può essere sviluppato per contenere studi sulle risposte immunitarie adattive aggiungendo cellule T autologhe insieme a macrofagi M1 o M2 in reazioni di linfociti misti (MRS). Il protocollo è adatto anche per lo screening dei farmaci e il test di diversi composti immunomodulatori e antimicrobici. Qui, abbiamo precedentemente studiato gli effetti della vitamina D e dell'inibitore della deacetilasi istono fenilbutirrato sulle cellule derivate dal mieloide dopo l'infezione da Mtb25,35. La citometria a flusso M1/M2 potrebbe anche essere utilizzata per valutare l'attivazione dei macrofagi dopo il condizionamento con supernanti di coltura cellulare o plasma del paziente. Mentre gli studi in vivo sulla co-infezione da TBC con HIV o elminti o co-morbilità da TBC-diabete potrebbero essere impegnativi, il modello M1/M2 meno complesso può facilitare gli studi sulle comorbilità in vitro. Allo stesso modo, il protocollo potrebbe essere sfruttato per studi di trasmissione per esaminare l'infettività mtb delle cellule o per studiare la capacità di presentazione fagocitica e antigene delle singole cellule M1/M2. La citometria a flusso M1/M2 è interessante anche per l'uso negli studi sui biomarcatori e sui vaccini, per seguire la prognosi della malattia durante il trattamento e per testare terapie mirate alle cellule derivate da mieloidi. È importante sottolineare che un certo numero di metodi diversi potrebbero essere applicati in parallelo alla citometria del flusso per la valutazione simultanea dei fenotipi di polarizzazione dei macrofagi e delle risposte funzionali utilizzando la microscopia confocale (Figura 3D), PCR in tempo reale, western blot, test multiplex ed ELISA di fattori solubili nel supernatante della coltura, nonché valutazione dell'infettività batterica intracellulare e della crescita utilizzando l'espressione GFP (citometria del flusso e microscopia confocale) e unità di formazione di colonie (CFU). L'infezione delle cellule M1 o M2 con batteri Mtb-GFP consente anche di ordinare le cellule non infette e infettate da Mtb dallo stesso campione per l'analisi del sequenziamento a singolo RNA cellulare.
Il protocollo descritto presenta anche alcune limitazioni, tra cui svantaggi tecnici e scientifici. Lo svantaggio dell'uso di macrofagi derivati dai monociti da donatori di sangue umano è che la variabilità del donatore è spesso elevata e il fatto che le cellule non sono polarizzate nell'ambiente fisiologico dei tessuti umani. Una grande variabilità nell'efficacia della polarizzazione M1/M2 o nell'infettività della mtb tra donatori può causare problemi con variazioni sia intra- che interespanimentali, bassa potenza statistica e la necessità di includere molti donatori per ottenere risultati affidabili. Inoltre, l'aderenza plastica dei monociti dai PBBC si traducono in un numero dipendente dal donatore di monociti / pozzo che può eventualmente fornire un MOI arbitrario che potrebbe influire sulla polarizzazione del macrofago e sulla vitalità cellulare dopo l'infezione da Mtb. I passaggi critici del protocollo comportano un corretto lavaggio per impedire ad altri tipi di cellule di contaminare le colture cellulari che potrebbero anche influenzare la polarizzazione dei macrofagi. Mentre un MOI troppo basso può imitare l'infezione da TBC latente, un MOI troppo alto ucciderà le cellule, evidenziando l'importanza di utilizzare un MOI appropriato. Inoltre, potrebbe essere difficile recuperare cellule saldamente aderenti al distacco, il che può comportare una rappresentazione distorta di alcuni sottoinsiemi di macrofagi utilizzati per le analisi della citometria del flusso. Un passo cruciale nell'analisi della citometria del flusso prevede l'uso corretto della matrice di compensazione delle perline e controlli negativi come le cellule non contaminate o i controlli FMO (Fluorescence Minus One) per garantire una corretta gating manuale.
Un'altra limitazione riguarda la polarizzazione dei monociti derivati dal sangue e non dall'ambiente tissutale locale. Il segno distintivo della TBC umana è la formazione di granulomi nei tessuti infetti da mtb e quindi l'immunopatologia nella TBC dovrebbe essere studiata preferenzialmente nel sito tissutale locale. Tuttavia, i monociti vengono reclutati al polmone dal sangue periferico all'infiammazione / infezione, dove le cellule possono differenziarsi in macrofagi in presenza di citochine infiammatorie come GM-CSF12. È importante sottolineare che, nell'ambiente fisiologico del tessuto in vivo, c'è probabilmente una grande eterogeneità della polarizzazione dei macrofagi tra cui una miscela e diversi rapporti di diverse popolazioni di macrofagi simili a M1 e M2 che contribuiscono al destino dell'infezione da TBC36. In precedenza abbiamo sviluppato un modello di tessuto polmonare organotipico umano che consente studi 3D sulla formazione di granuloma mediato da macrofagi nella TB37. Potrebbe essere interessante sfruttare l'attuale protocollo di polarizzazione M1/M2 in combinazione con il modello del tessuto polmonare per studiare ulteriormente la formazione di granuloma TB, le funzioni dell'effettore e il rapporto M1/M2 nel tessuto sperimentale.
Questo protocollo di citometria di flusso M1/M2 potrebbe essere prontamente adattato per includere un pannello esteso di marcatori mieloidi utili per la valutazione delle caratteristiche associate all'inibitoria e alle risposte infiammatorie. C'è un grande interesse di ricerca per molecole di checkpoint immunitario inibitorie come PD-1, SIRP-α, IDO e arginasi che potrebbero modulare le risposte ai macrofagi38. In questo contesto, la polarizzazione delle cellule mieloidi potrebbe anche comportare altri stimoli che promuovono macrofagi immunoregolatori (Mreg) o cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC) che hanno dimostrato di essere coinvolti in diverse malattie tra cui TB38. Pannelli di citometria a flusso più avanzati di sottoinsiemi di macrofagi M1/M2/Mreg possono anche includere colorazione intracellulare di citochine/chemiochine IL-1β, TNF-α, IL-10 e MCP-1 o altri fattori solubili o molecole di effettore come ossido nitrico induttibile (iNOS) e peptidi antimicrobici. Ciò potrebbe migliorare le possibilità di studiare risposte macrofagi polifunzionali, simili a quelle ampiamente descritte per le cellule T39.
Attualmente, i pannelli di colorazione citometrica a flusso possono includere fino a 30-40 colori, che fornisce la capacità di immunofenotipare più sottoinsiemi e molecole di cellule contemporaneamente. L'impostazione sperimentale di base di questo protocollo di citometria a flusso M1/M2 può essere utilizzata come spina dorsale compatibile con la maggior parte dei citometri a flusso vecchi e nuovi e può essere costruita e su misura in base alle esigenze individuali, comprese le sfide poste dal lavoro con Mtb virulento in un ambiente BSL-3. Al giorno d'oggi, le tecniche di riduzione della dimensionalità come UMAP sono disponibili nelle nuove versioni del software di citometria a flusso, che consente l'analisi di un gran numero di parametri generati in studi a cella singola che è essenziale per una migliore visualizzazione e interpretazione dei dati ad alta dimensione40. I costanti miglioramenti tecnologici nella citometria a flusso continueranno probabilmente nei prossimi anni, inclusa la combinazione di fenotipizzazione multi-parametrica insieme alle moderne capacità di smistamento cellulare, dove questo protocollo potrebbe rivelarsi utile in diversi saggi di infezione mtb basati su macrofagi.

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The author and affiliation information was&#160;updated from:
Akhirunnesa Mily1, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha2, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,3, Susanna Brighenti1 
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet&#160; 
2Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet&#160; 
3Childhood Cancer Research Unit, Department of Women&#39;s and Children&#39;s Health, Karolinska Institutet
to:
Akhirunnesa Mily1,2, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha3, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,4, Susanna Brighenti1 
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet&#160; 
2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research,&#160;Bangladesh 
3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet&#160; 
4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women&#39;s and Children&#39;s Health, Karolinska Institutet

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61807/polarization-m1-m2-human-monocyte-derived-cells-analysis-with-flow">Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection</a>. Author and affiliation information&#160;weas&#160;updated.

Erratum: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

I macrofagi sono cellule immunitarie che contribuiscono in modo significativo alla regolazione dell'omeostasi tissutale, dell'infiammazione e delle patologie delle malattie. Essendo una componente essenziale dell'immunità innata, il lignaggio monocita-macrofago delle cellule esprime fenotipi eterogenei in risposta a segnali ambientali alterati, che riflettono la loro plasticità e adattamento a diverse posizioni anatomiche e immunologiche1. A seconda dei fattori di crescita, delle citochine e di altri mediatori presenti nel microambiente, i macrofagi sono stati classificati in due grandi popolazioni reversibili, ognuna con un ruolo diverso nel controllo batterico e nella clearance2:i macrofagi polarizzati M1 pro-infiammatori, attivati classicamente e i macrofagi polarizzati M2 antinfiammatori e alternativamente attivati che sono stati originariamente nominati per imitare la nomenclatura cellulare T helper (Th)3. Questo raggruppamento di macrofagi polarizzati immunitari è spesso considerato semplicistico, poiché l'attivazione e la differenziazione del macrofago non è lineare, ma più accuratamente illustrata come un continuum in cui ogni popolazione ha caratteristiche e ruoli funzionali diversi nel risultato dello sviluppo e della progressione della malattia4,5,6,7. Tuttavia, ci sono numerosi vantaggi sperimentali con il modello di macrofago M1/M2 che possono essere utilizzati in diversi campi di ricerca.
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è l'agente causale della tubercolosi (TB) ed è stato stimato infettare una persona al secondo ed è considerato il singolo agente infettivo più letale al mondo (Global TB report 2019). Poiché le vie respiratorie sono la via principale dell'infezione da Mtb, i macrofagi alveolari sono le cellule ospiti preferite per essere infettate dalla Mtb e rappresentano sia le barriere primarie che il serbatoio infettivo per mtb nei polmoni. La polarizzazione del macrofago in risposta a diversi stimoli è stata ampiamente studiatanel corso degli anni 7 e nella maggior parte del lavoro pubblicato, La polarizzazione M1 delle colture di monociti in vitro è indotta dal fattore stimolante della colonia di granulociti-macrofagi (GM-CSF) insieme a IFN-γ e LPS8,9 ,mentrela polarizzazione M2 è indotta con fattore stimolante della colonia di macrofagi (M-CSF) e IL-410,11. I macrofagi M1 sono potenti cellule effettori che mediano le risposte antimicrobiche contro gli agenti patogeni intracellulari e hanno un ruolo essenziale nell'immunità antitumorale12. I macrofagi M2, d'altra parte, hanno una funzione antinfiammatoria, alta capacità fagocitica e sono principalmente coinvolti nella guarigione delle ferite e nella riparazione dei tessuti, nonché nelle infezioni parassitarie12. Di conseguenza, i macrofagi M1 sono visti come più efficaci nel controllo intracellulare della Mtb rispetto ai macrofagi M213. Tuttavia, i batteri Mtb hanno anche il potenziale per modulare la polarizzazione dei macrofagi per sovvertire l'immunità innata14,15,16,17.
Mentre è comune generare macrofagi dalla differenziazione dei monociti ottenuti dalsangue periferico 18, i macrofagi potrebbero anche essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC)19 o da macrofagi derivati dal midollo osseodai topi 20,21. Queste sono tecniche fattibili per studiare le cellule primarie di macrofagi ottenute da progenitori monociti /macrofagi che prolifereranno e si distingueranno in una popolazione omogenea di cellule mature simili a macrofagi. Tuttavia, questi protocolli raramente forniscono conoscenze approfondite sul fenotipo e sulla funzione delle cellule ottenute né tengono conto dell'eterogeneità naturale osservata tra i macrofagi ottenuti in vivo. Poiché mtb è un rigoroso agente patogeno umano, c'è anche un vantaggio nello studio della Mtb nei sistemi modello umanizzati. La citometria a flusso è una potente tecnologia che offre la possibilità di valutare molteplici caratteristiche fenotipiche e funzionali di singole cellule in sospensione22,qualcosa che potrebbe essere abbastanza impegnativo con cellule aderenti come i macrofagi che sono anche noti per essere autofluorescenti23,24. Oltre al distacco chimico di macrofagi saldamente aderenti, l'infezione da Mtb può rappresentare un fattore di stress significativo per le cellule che aggiunge un altro livello di complessità nelle analisi citometriche del flusso dei macrofagi infetti da Mtb.
In questo protocollo sperimentale, abbiamo utilizzato un modello di infezione da macrofagi umani precedentemente stabilito basato sulla polarizzazione immunitaria di cellule primarie derivate da periferici-sangue-monociti che sono infettate dal virulento laboratorio Mtb strain H37Rv, e analizzate con citometria di flusso utilizzando un pannello a 10 colori che include l'espressione di marcatori M1 e M2selezionati 25. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e riproducibile per studiare le risposte all'infezione da Mtb nei macrofagi polarizzati derivati dai monociti M1 o M2. Inoltre, l'uso della citometria di flusso su macrofagi aderenti infettati da Mtb ci consente di studiare una varietà di marcatori superficiali associati ai macrofagi convenzionali M1 e M2 e alla loro risposta longitudinale all'infezione da Mtb. È importante sottolineare che questo protocollo può essere facilmente adottato per le indagini sulle infezioni con altri agenti patogeni, negli studi antitumorali o negli studi sulle condizioni infiammatorie, per lo screening dei farmaci ecc. e potrebbe anche essere sfruttato per la valutazione della polarizzazione del macrofago M1 /M2 in campioni clinici umani.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Comp bead plus</td>
			<td>BD</td>
			<td>560497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting media</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5 M)</td>
			<td>Karolinska University hospital, Huddinge</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6-well Flat Bottom plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (70%)</td>
			<td>Karolinska University hospital, Huddinge</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37121</td>
			<td>Secondary antibody for CD64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td>Secondary antibody for CD163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS (Escherichia coli O55:B5)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS</td>
			<td>11508545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middle Brook 7H10 agar plates</td>
			<td>Karolinska University hospital, Huddinge</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middle Brook 7H9 media</td>
			<td>Karolinska University hospital, Huddinge</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD64 primary antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA756G</td>
			<td>Clone: 10.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH300239.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human CD163 primary antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX81526</td>
			<td>Polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>SH30096.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TubeSpin bioreactor tubes</td>
			<td>TPP Techno Plastic Products AG</td>
			<td>87050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polarization of m1 and m2 human monocyte-derived cells and analysis with flow cytometry upon mycobacterium tuberculosis infection

I macrofagi umani sono cellule ospiti primarie dell'infezione da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) intracellulare e quindi hanno un ruolo centrale nel controllo immunitario della tubercolosi (TB). Abbiamo stabilito un protocollo sperimentale per seguire la polarizzazione immunitaria delle cellule derivate da mieloidi in cellule simili a macrofagi M1 (attivate classicamente) o M2 (attivate alternativamente) attraverso la valutazione con un pannello citometrico a flusso a 10 colori che consente la visualizzazione e la caratterizzazione profonda di Mtb etichettato verde-proteina fluorescente (GFP) in diversi sottoinsiemi di macrofagi. I monociti ottenuti da donatori di sangue sani sono stati polarizzati in cellule M1 o M2 utilizzando la differenziazione con fattore stimolante della macrofagia granulocita (GM-CSF) o fattore stimolante della macrofagia-colonia (M-CSF) seguita da polarizzazione rispettivamente con IFN-γ e lipoppiosaccaride (LPS) o IL-4. Le cellule M1 e M2 completamente polarizzate sono state infettate da Mtb-GFP per 4 ore prima che i macrofagi infetti da Mtb staccati fossero macchiati di citometria a flusso a 4 o 24 ore dopo l'infezione. L'acquisizione del campione è stata eseguita con citometria a flusso e i dati sono stati analizzati utilizzando un software di analisi della citometria a flusso. Sono state eseguite la gating manuale e la riduzione della dimensionalità con l'analisi UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) e fenografica. Questo protocollo ha portato a un'efficace polarizzazione M1/M2 caratterizzata da livelli elevati di CD64, CD86, TLR2, HLA-DR e CCR7 su celle M1 non infette, mentre le celle M2 non infette presentavano una forte regolazione dei marcatori fenotipo M2 CD163, CD200R, CD206 e CD80. Le cellule polarizzate M1 in genere contenevano meno batteri rispetto alle cellule polarizzate M2. Diversi marcatori M1/M2 sono stati downregolati dopo l'infezione da Mtb, il che suggerisce che mtb può modulare la polarizzazione dei macrofagi. Inoltre, 24 diversi gruppi cellulari di diverse dimensioni sono stati distribuiti in modo univoco tra le cellule non infette M1 e M2 e infettate da Mtb a 24 ore dopo l'infezione. Questo protocollo di citometria a flusso M1/M2 potrebbe essere utilizzato come spina dorsale nella ricerca mtb-macrofagi ed essere adottato per esigenze speciali in diversi settori di ricerca.

Un'illustrazione schematica delle stimolazioni citochine utilizzate per la polarizzazione delle cellule derivate dai monociti in M0 (cellule simili a M2), M1 (cellule M1 completamente polarizzate) e M2 (cellule M2 completamente polarizzate) è presentata nella figura 1A, mentre le immagini rappresentative delle colture cellulari M0, M1 e M2 e delle colture M1 al giorno 0, 3 e 7, sono mostrate nella figura 1B. Le celle M0 non infette sono state utilizzate per dimostrare la strategia di base della gating (Figura 2A). Inizialmente, le cellule mieloidi (~85%) sono state gated in base alle loro proprietà di dispersione in avanti (FSC) e dispersione laterale (SSC), comprese le celle più grandi con elevata granularità ed escludendo i detriti di piccole dimensioni con un basso SSC e FSC che si trovano nell'angolo in basso a sinistra del grafico a punti. Nel secondo grafico, i farsa (cioè i grumi cellulari) sono stati definiti come aventi un'area aumentata ma un'altezza simile rispetto alle singole cellule e sono stati esclusi da ulteriori analisi. Pertanto, solo le celle proporzionate tra FSC-Area e FSC-Height (singole celle) sono state incluse all'interno del cancello della forma inclinata. Successivamente, il colorante zombie-UV che macchia le proteine citoplasmatiche all'interno delle cellule morte, è stato utilizzato per escludere le cellule morte dalle analisi successive. Come previsto, le cellule M0 non infette vitali erano negative per l'espressione Mtb-GFP visualizzato nel canale FITC.
Successivamente, abbiamo applicato la stessa strategia di gating ai macrofagi M1 e M2 infetti da Mtb a 4 ore dopo l'infezione(Figura 2B,C). Due sotto-popolazioni sono state rilevate nella porta FCS/SSC di macrofagi polarizzati M1 non infetti; una popolazione con dimensioni più piccole (FCS) e maggiore granularità (SSC) e l'altra popolazione con dimensioni maggiori e granularità inferiore (Figura 2B), mentre la porta principale delle celle M2 non infette è apparsa più omogenea (Figura 2C). Sia le cellule derivate da monociti M1 che M2 hanno mostrato uno spostamento verticale verso una maggiore granularità e una ridotta dimensione cellulare all'infezione da Mtb, che può riflettere una maggiore complessità all'interno delle cellule causata dall'assorbimento di batteri Mtb intracellulari (Figura 2B,C). Inoltre, la macchia di vitalità ha rivelato una morte cellulare migliorata (17-22%) tra le cellule M1 e M2 infettate da Mtb con un MOI di 5, rispetto alle cellule M0 non infette (99%) (Figura 2Celle A-C) o M1 e M2 non infette (dati non visualizzati). I dati rappresentativi hanno mostrato che l'espressione mtb-GFP (cioè l'infettività mtb) era sostanzialmente più alta nelle cellule M2 (77% GFP-positive) rispetto alle cellule M1 (19% cellule positive alla GFP) dopo 4 ore di infezione(figura 2B,C). Dopo 24 ore di infezione, l'espressione mtb-GFP era rispettivamente del 43% e dell'85% nelle cellule M1 e M2, suggerendo che le cellule M1 avevano un aumento relativamente più elevato dell'espressione della GFP da 4 a 24 ore dopo l'infezione da Mtb rispetto alle cellule M2, rispettivamente del 126% contro il 10,4% dell'espressione GFP nelle cellule M1 e M2 da 4 a 24 ore.
Per caratterizzare l'efficacia della polarizzazione M1/M2 in cellule derivate da monociti non infetti, sono stati utilizzati grafici a punti per identificare le cellule M1 che erano double-positive per CD64 e CD86 (CD64+CD86+) e M2 che erano double-positive per CD163 e CD200R (CD163+CD200R+; Figura 3A,B). La selezione dei marcatori M1/M2 è stata effettuata principalmente sulla base dei risultati del nostro precedentelavoro 25 ma anche da altristudi 26,27,28,29. I quadranti per le celle macchiate, sono stati impostati utilizzando cancelli corrispondenti per celle M1/M2 non macchiate (Figura 3A). Nessuno di questi marcatori è espresso esclusivamente da cellule M1 o M2, ma la proporzione di cellule positive e l'intensità dell'espressione superficiale è diversa. Ciò è stato particolarmente evidente dalla macchia M1, dove circa il 95% delle cellule M1 e il 79% delle cellule M2 erano CD64+CD86+, ma l'intensità di colorazione era sostanzialmente più elevata nel sottoinsieme M1(Figura 3A). Mentre il 27% delle cellule M1 era positivo per il CD200R marcatore M2, solo l'1% era positivo per CD163, fornendo lo 0,5% di cellule CD163+CD200R+ M1 rispetto al 63% di cellule CD163+CD200R+ M2(Figura 3A). Dopo 4 ore di infezione da Mtb, è stato osservato un aumento della frequenza delle cellule CD200R+ nelle cellule polarizzate Mtb-GFP-positive M1 (16%), mentre l'espressione cd163 è stata ridotta nelle cellule M2 (Figura 3B). La mappa termica mostra un'alta intensità di espressione GFP nelle celle CD163+CD200R+ M2, ma anche nel sottoinsieme CD64+CD86+ M2 rispetto ai sottoinsiemi di celle M1 corrispondenti (Figura 3B). Nel complesso, lo spostamento nell'espressione dei rispettivi marcatori M1 e M2 viene visualizzato anche negli istogrammi nella figura 3C. Inoltre, i batteri Mtb-GFP sono stati visualizzati anche nelle cellule CD64+ M1 e nelle cellule CD163+ M2 mediante microscopia confocale, che supportava un maggiore assorbimento intracellulare e/o crescita della Mtb all'interno di M2 rispetto alle cellule M1(Figura 3D).
Per verificare i risultati della gating manuale, abbiamo applicato la riduzione della dimensionalità utilizzando UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection). L'analisi dell'UMAP ha mostrato che l'infezione da Mtb per 4 ore non era sufficiente a influenzare la polarizzazione dei macrofagi, a differenza di 24 ore di infezione, il che ha portato a cluster chiaramente separati di cellule non infette e infette da M1 e M2 (Figura 4A). I macrofagi M1 non infetti mostravano un'espressione più elevata di CD64, CD86, TLR2, HLA-DR e CCR7 rispetto ai macrofagi M2, mentre le celle M2 non infette mostravano una forte regolazione dei marcatori fenotipo M2 CD163, CD200R, CD206 e CD80(Figura 4B,C). In accordo con la gating manuale, l'infezione da Mtb dopo 24 ore ha causato una netta downregolazione di CD163, CD200R e CD206 sulle cellule M2 e l'upregolazione di CD86 e HLA-DR su cellule M1 (Figura 4B,C), il che suggerisce che mtb può modulare la polarizzazione del macrofago. La successiva analisi fenografica (figura 4D-F) ha identificato 24 diversi cluster di diverse dimensioni che sono stati distribuiti in modo univoco tra le cellule non infette m1 e M2 e infettate da Mtb, come illustrato nei grafici UMAP (Figura 4D), grafici a torta (Figura 4E) e mappe di calore(figura 4F). Complessivamente, questi risultati mostrano una promettente efficienza di questo protocollo per generare cellule polarizzate M1 e M2 fenotipicamente e funzionalmente diverse in vitro che sono ulteriormente modulate dall'infezione da Mtb.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61807/61807fig01.jpg"> Figura 1: Illustrazione schematica della differenziazione in vitro e della polarizzazione delle cellule derivate dal mieloide umano. (A) Sono raffigurate cellule M0 (simili a M2), M1 (attivate classicamente) e M2 (attivate alternativamente). I monociti ottenuti da donatori di sangue sani sono stati polarizzati con diverse citochine come descritto nel protocollo e infettati dal ceppo mtb etichettato GFP, H37Rv, per 4 ore prima dell'analisi con citometria a flusso a 10 colori. Le cellule polarizzate M1 in genere contengono meno batteri rispetto alle cellule polarizzate M2. (B) Immagini microscopiche di cellule M0, M1 e M2 completamente polarizzate, non infette nelle piastre a 6 pozzi al giorno 7 e immagini rappresentative della differenziazione cellulare M1 dai monociti ai giorni 0, 3 e 7. L'ingrandimento è 20x (pannello superiore) e 10x (pannello inferiore). Si noti che le celle M1 sono più allungate e allungate rispetto alle celle M0 e M2 più arrotondate (pannello superiore). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61807/61807fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61807/61807fig2v2.jpg"> Figura 2: Strategia di Gating delle cellule derivate da mieloidi polarizzate differenzialmente. Grafici rappresentativi dei punti che mostrano le proprietà (A) Forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) dei macrofagi M0 non infetti. Il grafico FSC-A/FSC-H mostra la gating manuale di singole cellule proporzionate per area e altezza. Il cancello della cellula viva escludeva le cellule positive per zombie-UV (colorante di vitalità). La Mtb intracellulare è stata rilevata dall'espressione GFP nelle cellule vive osservate nel canale FITC. (B) Gating di macrofagi M1 e (C) M2 che mostrano grafici a punti FCS/SSC sia nelle cellule non infette che nelle cellule infettate da Mtb 4 h e 24 h dopo l'infezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61807/61807fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61807/61807fig03v4.jpg"> Figura 3: Efficacia del protocollo di polarizzazione M1/M2 in vitro. Grafici rappresentativi di punti e gating quadrante che mostrano le frequenze sottoinsiemi delle cellule polarizzate M1 e M2 utilizzando cellule non infette CD64 e CD86 (M1) o CD163 e CD200R (M2) in (A) cellule non infette non contaminate e macchiate e(B)cellule macchiate in mtb 4 h dopo l'infezione. I grafici a punti in (B) illustrano l'intensità di fluorescenza dell'espressione GFP (mappa termica) nei macrofagi polarizzati M1 e M2 ottenuti da diverse sottoporte. (C) La media geometrica dell'intensità della fluorescenza (IFM) è indicata negli istogrammi di un donatore rappresentativo dopo 4 ore di infezione da Mtb. I valori delle IFM nelle cellule M1 (azzurro) e M2 non infette (viola chiaro) sono presentati nel pannello superiore e le cellule M1 (blu intenso) e M2 infettate da Mtb (viola intenso) sono presentate nel pannello inferiore. (D) Vengono mostrate immagini confocali rappresentative di cellule polarizzate M1 e M2 non infette e infettate da Mtb. Le cellule M1 e M2 sono state macchiate rispettivamente per l'espressione CD64 e CD163, usando l'immunofluorescenza. La colorazione positiva della superficie è mostrata nei batteri intracellulari rossi e che esprimono GFP è mostrata in verde. I nuclei macchiati di DAPI sono mostrati in colore blu. Scala - 10 μm. L'ingrandimento delle immagini a destra è 350x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61807/61807fig03v4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61807/61807fig04.jpg"> Figura 4: Riduzione della dimensionalità con UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) e analisi fenografica di cellule M1 e M2 non infettate e infettate da Mtb. (A) UMAP, creato concatenando 11000 cellule vive provenienti da colture cellulari M1 e M2 non infette e infettate da Mtb da due donatori rappresentativi di sangue, 4 ore (grafici a sinistra) o 24 ore (grafici a destra) dopo l'infezione. La mappa termica per l'espressione GFP (pannello inferiore) indica cellule non infette e infettate da Mtb. (B-C) IFM di marcatori espressi in cellule M1 e M2 non infette e infettate da Mtb 24 ore dopo l'infezione, indicate come(B)mappa termica o(C)grafici a barre. (D-F) L'analisi del fenografo ha identificato 24 cluster che sono distribuiti in modo differenziato tra le colture M1 e M2 non infettate e infettate da Mtb. Gli ammassi 8-13 sono unici nelle cellule M1 non infette, gli ammassi 1-7 sono unici nelle cellule M1 infettate da Mtb, i cluster 20-24 sono unici nelle cellule M2 non infette e i cluster 14-19 sono unici nelle cellule M2 infettate da Mtb. Le IFM di ciascun marcatore in ogni cluster di fenografi sono indicate in (F). I dati sono presentati come cellule M1 (azzurro) e M2 non infette (viola chiaro) e M1 (blu intenso) e M2 infettate da Mtb (viola intenso) e M2 (viola intenso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61807/61807fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Elenco degli anticorpi utilizzati per la citometria del flusso.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>laser</td>
			<td>filtro</td>
			<td>fluorocromo</td>
			<td>fenotipo</td>
			<td>funzione</td>
			<td>clone</td>
			<td>N. catalogo</td>
			<td>società</td>
		</tr>
<tr>
<td>639</td>
			<td>670/30</td>
			<td>AF647</td>
			<td>TLR2</td>
			<td>Recettore del riconoscimento degli agenti patogeni</td>
			<td>TL2.1</td>
			<td>309714</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>639</td>
			<td>780/60</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>Cd206</td>
			<td>Recettore del mannosio</td>
			<td>15-2</td>
			<td>321120</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>405</td>
			<td>610/20</td>
			<td>BV605</td>
			<td>Cd163</td>
			<td>Recettore degli spazzini</td>
			<td>Ghi/61</td>
			<td>333616</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>405</td>
			<td>670/30</td>
			<td>BV650</td>
			<td>CD80</td>
			<td>Molecola co-stimolante</td>
			<td>2D10</td>
			<td>305227</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>405</td>
			<td>710/50</td>
			<td>BV711</td>
			<td>CCR7</td>
			<td>Recettore delle chemiochine</td>
			<td>G043H7</td>
			<td>353228</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>405</td>
			<td>780/60</td>
			<td>BV785</td>
			<td>CD86</td>
			<td>Molecola co-stimolante</td>
			<td>IT2.2</td>
			<td>305442</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>488</td>
			<td>530/30</td>
			<td>GFP</td>
			<td>Mtb</td>
			<td>Batteri intracellulari</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>561</td>
			<td>586/15</td>
			<td>Pe</td>
			<td>CD200R</td>
			<td>Recettore inibitorio</td>
			<td>OX-108</td>
			<td>329306</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>561</td>
			<td>620/14</td>
			<td>PE/DAZZLE 594</td>
			<td>Cd64</td>
			<td>Recettore gamma Fc-I di IgG</td>
			<td>10.1</td>
			<td>305032</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>561</td>
			<td>661/20</td>
			<td>PE-Cy5 (PC5)</td>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>Molecola MHC classe II</td>
			<td>L243</td>
			<td>307608</td>
			<td>BioLegend</td>
		</tr>
<tr>
<td>355</td>
			<td>450/50</td>
			<td>BUV395</td>
			<td>Colorante di vitalità</td>
			<td>Marcatore cellulare vivo/morto</td>
			<td>Zombie UV</td>
			<td>423108</td>
			<td>Invitrogeno</td>
		</tr>
</tbody></table>

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Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

Questo protocollo fornisce un metodo per studiare l'infezione da Mycobacterium tuberculosis nei macrofagi polarizzati M1 o M2 umani basati sulla differenziazione dei monociti del sangue periferico alle cellule simili a macrofagi che sono infettate dal ceppo virulento H37Rv etichettato GFP e analizzate con citometria a flusso utilizzando un pannello a 10 colori che include l'espressione di marcatori M1/M2 selezionati.

Polarizzazione delle cellule derivate da monociti umani M1 e M2 e analisi con citometria a flusso sull'infezione da tubercolosi del micobatterio

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

27.7K Views.  Karolinska Institutet. Questo protocollo fornisce un metodo per studiare l'infezione da Mycobacterium tuberculosis nei macrofagi polarizzati M1 o M2 umani basati sulla differenziazione dei monociti del sangue periferico alle cellule simili a macrofagi che sono infettate dal ceppo virulento H37Rv etichettato GFP e analizzate con citometria a flusso utilizzando un pannello a 10 colori che include l'espressione di marcatori M1/M2 selezionati.

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Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analisi di 18FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...