La lignina è un eteropolimero complesso composto da tre monoligoli. È il secondo polimero più abbondante al mondo vicino alla cellulosa. Qui, dimostriamo il metodo dell'acido tioglicolico, che è il metodo più affidabile per la stima del contenuto di lignina.
Questo metodo si basa sul principio che la lignina si lega all'acido tioglicolico attraverso legami di tioetere. Inoltre, abbiamo diviso questo protocollo in cinque fasi. Nella prima fase, prepariamo il materiale vegetale.
Nella seconda fase, isoliamo l'estratto insolubile di alcol. Nella terza fase, precipitiamo la lignina usando acido tioglicolico e condizioni acide. Nella quarta fase, prepariamo la curva standard di lignina usando lignina di bambù industriale.
Infine, nella quinta fase, stimiamo il contenuto di lignina utilizzando la curva standard preparata nella quarta fase. Il materiale vegetale viene raccolto, capovolto i vasi per separare le radici, lavato accuratamente in acqua, asciugato all'aria per due giorni, trasferito in contenitori etichettati e incubato nell'incubatrice a 49 gradi centigradi per una settimana a 10 giorni. Usando le forbici, il tessuto viene ulteriormente tagliato in pezzi di dimensioni da 1 mm a 3 mm.
In alternativa, la smerigliatrice a biomassa viene utilizzata per schiacciare i tessuti vegetali. Utilizzare il tessuto radicale Accendere la smerigliatrice a biomassa raccogliere la polvere frantumata in contenitori preetito. Allo stesso modo, ripetere per il tessuto stelo e il tessuto fogliare.
La polvere frantumata viene caricata nel vaso di macinazione che viene quindi collocata nel congelatore E eseguire il congelatore alla velocità di 10 CP per tre cicli. Pesare 20 mg della polvere di tessuto macinato e trasferirli in un tubo prefazione da 2 ml. Prendere nota del tubo vuoto e del tubo con polvere di tessuto e polvere di tessuto nel notebook del laboratorio.
Incubare i tubi con tappo aperto a 60 gradi centigradi per un'ora. Dopo l'incubazione, aggiungere 1,8 ml di acqua a ciascuna centrifuga del vortice campione a 15.000 giri/min per 10 minuti. Scartare il supernatante Aggiungere 1,8 ml di metanolo.
Vortice e incubare in un blocco centigrado preriscaldato di 60 gradi per 20 minuti Dopo la centrifuga di incubazione a 15.000 giri/min per 10 minuti. Ripetere questo passaggio ancora una volta. Dopo la centrifugazione scartare il supernatante e asciugare i pellet nell'essiccatore sottovuoto per due o tre ore o fino a quando il pallet non è completamente asciutto.
Misurare e registrare il peso di ogni tubo nel notebook da laboratorio per la stima del contenuto di lignina alla fine. Includere anche il controllo positivo della lignina di bambù industriale a questo punto a partire da 0,5 mg a 4 mg nei triplicati. Aggiungere 1 ml di 3 normale acido cloridrico, insieme a cento microlitri di acido glicolico ad ogni vortice campione e incubare a 80 gradi centigradi per 3 ore.
Dopo 3 ore di incubazione trasferirli su un rack e lasciare raffreddare per 10 minuti. quindi centrifugare a 15.000 giri/min per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, il colore della soluzione è simile a questo.
Scartare il supernatante. Aggiungere 1 ml di acqua. Centrifuga vortice a 15.000 giri/min per 10 minuti.
Scartare il supernatante. Aggiungere 1 ml di 1 idrossido di sodio normale. Vortice e incubare a 37 gradi centigradi shaker durante la notte.
Dopo la centrifugazione dell'incubazione notturna i tubi a 15.000 giri/min per 10 minuti. Trasferire i tubi freschi supernatanti preetichettati da 2 ml aggiungere 200 microlitri di acido cloridrico concentrato al supernatante. Mescolarli con una leggera inversione come mostrato qui.
Incubarli in frigorifero a 4 gradi centigradi durante la notte. Dopo la centrifuga di incubazione a 15.000 giri/min per 10 minuti. Scartare il supernatante.
Aggiungere 1 ml di idrossido di sodio. Vortice e incubare nello shaker a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Utilizzare lo spettrofotometro per raccogliere le letture di assorbanza di 280 nanometri, Prendere 2 microlitri di idrossido di sodio come vuoto poiché la lignina precipitata viene sciolta in idrossido di sodio.
Rendi lo spazio vuoto a zero. Allo stesso modo, ripetere per i campioni. Utilizzare due microlitri di ogni campione per raccogliere le letture di assorbanza nel notebook del laboratorio.
Prendi tre letture per ogni campione per tre repliche tecniche. Nella prima colonna, abbiamo il numero di campione. Nella seconda colonna, abbiamo repliche biologiche in cui R1, R2, R3 rappresentano tre repliche biologiche di una linea sperimentale.
Nella terza colonna, abbiamo mediato le letture di assorbanza ottenute a 280 nanometri. Abbiamo calcolato il contenuto di lignina nella quarta colonna usando la formula y=mx-c dove x è l'OD medio.m e i valori c vengono tracciati dalla linea di regressione della curva standard preparata. La quinta colonna è il peso dopo i lavaggi di metanolo e acqua.
Quindi questo è il modo in cui viene utilizzato per la stima del contenuto di lignina in mg. Quindi dividiamo il valore ottenuto nella quarta colonna per quinta colonna per ottenere il valore per mg di contenuto di lignina nella sesta colonna. E questo valore viene moltiplicato per 1000 per ottenere il peso della parete cellulare per grammo.
E il contenuto di lignina percentuale viene calcolato dividendo questo valore per 1000 e moltiplicando per 100. Infine, otteniamo la lignina media calcolando la media della lignina di tre repliche biologiche di ciascuna linea sperimentale che saranno confrontate con la media di un'altra linea sperimentale sotto forma di un grafico a barre per comprendere le differenze nel contenuto di lignina. Possiamo anche applicare il test t degli studenti per testare il loro livello di significatività.
Nella colonna A, abbiamo la lignina di bambù commerciale, e poi il peso della lignina di bambù che è stata presa prima del TGA e le loro rispettive letture di assorbanza a 280 nanometri. Questi valori nella tabella A sono stati utilizzati per tracciare un grafico sparso nella colonna B, che ci fornisce la linea di regressione con valori m e c. In C, abbiamo confrontato i valori ottenuti utilizzando la curva standard e la linea sperimentale industriale di lignina di bambù uno e due sono stati confrontati sotto forma di grafico a barre e il risultato è che mostrano differenza tra loro.
