Lignina é um heteropolímero complexo composto por três monolignols. É o segundo polímero mais abundante na Terra ao lado da celulose. Aqui, demonstramos o método de ácido tioglicólico, que é o método mais confiável para a estimativa do conteúdo de lignina.
Este método baseia-se no princípio de que a lignina se liga ao ácido tioglicólico através de ligações de tiosether. Além disso, dividimos este protocolo em cinco fases. Na primeira fase, preparamos o material da planta.
Na segunda fase, isolamos o extrato insolúvel do álcool. Na terceira fase, precipitamos a lignina usando ácido tioglicóclico e condições ácidas. Na quarta fase, preparamos a curva padrão da lignina usando a lignina de bambu industrial.
Finalmente, na quinta fase, estimamos o teor de lignina utilizando a curva padrão preparada na quarta fase. O material vegetal é coletado, virou os vasos para separar as raízes, lavou-as completamente em água, secou o ar por dois dias, transferiu-os para recipientes rotulados e incubaram-nos na incubadora a 49 graus centígrados por uma semana a 10 dias. Com a tesoura, o tecido é ainda mais cortado em pedaços de tamanho de 1 mm a 3 mm.
Alternativamente, o moedor de biomassa é usado para esmagar os tecidos vegetais. Use o tecido radicular Ligue o moedor de biomassa para coletar o pó esmagado em recipientes pré-rotulados. Da mesma forma, repita para o tecido do caule e tecido da folha.
O pó triturado é carregado no vaso de moagem que são então colocados no moinho de congelador e executam o moinho de congelador à taxa de velocidade de 10 CP por três ciclos. Pese 20 mg do pó de tecido moído e transfira para um tubo pré-fabricado de 2ml. Anote o tubo vazio e o tubo com pó de tecido e o pó de tecido no seu caderno de laboratório.
Incubar os tubos com tampa aberta a 60 graus centígrados por uma hora. Após a incubação, adicione 1,8 ml de água a cada centrífuga de vórtice de amostra a 15.000 RPM por 10 minutos. Descarte o supernatante Adicione 1,8 ml de metanol.
Vórtice e incubação em um bloco centígrado pré-aquecido de 60 graus por 20 minutos Após a centrífuga de incubação a 15.000 RPM por 10 minutos. Repita este passo mais uma vez. Após a centrifugação descarte o supernasce e seque as pelotas no secador de vácuo por duas a três horas ou até que a palete esteja completamente seca.
Meça e regisse o peso de cada tubo em seu caderno de laboratório para a estimativa do conteúdo de lignina no final. Inclua também o controle positivo da lignina industrial de bambu neste ponto a partir de 0,5 mg a 4 mg em triplicados. Adicione 1 ml de ácido clorídrico normal, juntamente com cem microliters de ácido glicólico a cada amostra de Vórtice e incubar a 80 graus centígrados por 3 horas.
Após 3 horas de incubação, transfira-os para um rack e deixe esfriar por 10 minutos. em seguida, centrífuga a 15.000 RPM por 10 minutos. Após a centrifugação, a cor da solução se parece com esta.
Descarte o supernaspeso. Adicione 1 ml de água. Vortex Centrífuga a 15.000 RPM por 10 minutos.
Descarte o supernaspeso. Adicione 1 ml de hidróxido de sódio normal. Vórtice e incubar a 37 graus agitador centígrado durante a noite.
Após a incubação durante a noite, centrifugar os tubos a 15.000 RPM por 10 minutos. Transfira os tubos de 2 ml frescos supernacantados adicionam 200 microliters de ácido clorídrico concentrado ao sobrenante. Misture-os por uma inversão suave como mostrado aqui.
Incuba-os na geladeira a 4 graus centígrados durante a noite. Após a incubação centrífuga a 15.000 RPM por 10 minutos. Descarte o supernaspeso.
Adicione 1 ml de hidróxido de sódio. Vórtice e incubar no shaker à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Use espectrofotômetro para coletar as leituras de absorvência 280 nanômetros, Tome 2 microliters de hidróxido de sódio como em branco, uma vez que a lignina precipitada é dissolvida em hidróxido de sódio.
Faça o branco a zero. Da mesma forma, repita para as amostras. Use dois microliters de cada amostra para coletar as leituras de absorvência em seu caderno de laboratório.
Faça três leituras para cada amostra para três réplicas técnicas. Na primeira coluna, temos o número da amostra. Na segunda coluna, temos réplicas biológicas onde R1, R2, R3 representam três réplicas biológicas de uma linha experimental.
Na terceira coluna, tivemos uma média das leituras de absorvência obtidas em 280 nanômetros. Calculamos o teor de lignina na quarta coluna usando a fórmula y=mx-c onde x é o OD médio.m e c valores são plotados a partir da linha de regressão da curva padrão preparada. Quinta coluna é o peso depois do metanol e lavagem de água.
Então é assim que é usado para a estimativa do conteúdo de lignina em mg. Assim dividimos o valor obtido na quarta coluna por quinta coluna para obter o valor por mg de conteúdo de lignina na sexta coluna. E esse valor é multiplicado por 1000 para obter por grama de peso da parede celular.
E o conteúdo percentual de lignina é calculado dividindo esse valor por 1000 e multiplicando por 100. Finalmente, obtemos a lignina média, com uma média da lignina de três réplicas biológicas de cada linha experimental que será comparada com a média de outra linha experimental na forma de um gráfico de barras para entender as diferenças no teor de lignina. Também podemos aplicar o teste t estudantil para testar seu nível de significância.
Na coluna A, temos lignina comercial de bambu, e então o peso da lignina de bambu que foi tomada antes da TGA e suas respectivas leituras de absorvência a 280 nanômetros. Esses valores na tabela A foram utilizados para traçar um gráfico disperso na coluna B, o que nos dá a linha de regressão com valores m e c. Em C, comparamos os valores obtidos utilizando a curva padrão e a linha experimental de bambu industrial ligina um e dois foram comparados na forma de um gráfico de barras e o resultado é que eles mostram diferença entre si.
