Questo metodo fornisce soluzioni per le domande biologiche impegnative di oggi. Da un esperimento FPOP in-cell, possiamo studiare le interazioni proteina-ligando, i siti di interazione proteina-proteina e le regioni di cambiamento conformazionale. Il vantaggio di questa tecnologia è l'uso di una piattaforma IC-FPOP automatizzata a sei pozzi basata su piastre che consente di far crescere le cellule ed eseguire studi FPOP in cella direttamente al laser.
Questo metodo può essere utilizzato nelle industrie farmaceutiche e biotecnologiche, così come nei principali istituti di ricerca accademica e clinica, in particolare dagli investigatori biologici nelle università che studiano la dinamica proteica. Per iniziare, svitare l'incubatore della piattaforma dalla fase di posizionamento e scollegare le linee di temperatura, gas e umidificatore. Spruzzare l'incubatore con il 70% di etanolo e posizionare nella cappa di coltura cellulare.
Rimuovere la piastra a sei porri dall'incubatore della piattaforma, fissare il coperchio originale della piastra e confermare la confluenza cellulare utilizzando un microscopio, quindi posizionare la piastra a sei porri con celle confluenti nell'incubatore della piattaforma all'interno del cappuccio di coltura cellulare. Inserire tre tubi Tygon pretarsi in ogni pozzo tramite le porte incorporate lavando i tubi alle pareti del pozzo e fissarli con anelli stampati in 3D personalizzati. Preparare uno script software di integrazione per il prelievo della pompa.
Utilizzare una pompa peristaltica per rimuovere completamente i supporti cellulari da tutti e sei i pozzi. I solventi primi in ogni canale delle altre tre pompe peristaltiche, quindi infondono perossido di idrogeno e tampone di tempra nei rispettivi tubi alternati fino a quando i reagenti raggiungono le porte dell'incubatore. Verificare che il raggio laser sia stato angolato correttamente e raggiunga l'incubatore disinibito.
Controllare l'energia laser utilizzando un sensore esterno. Preparare lo script del software di integrazione per l'infusione della pompa dopo aver confermato l'allineamento del fascio. Infondere 200 millimolare perossido di idrogeno a 35 millilitri al minuto nel primo pozzo.
Premere il pulsante di avvio sul software laser al segno di cinque secondi per attivare l'impulso al segno di 11 secondi sul timer. Infondere soluzione di tempra da 125 millimolare a 35 millilitri al minuto nel primo pozzo immediatamente dopo l'impulso laser. Spostare manualmente la fase di posizionamento per allineare il pozzo successivo al raggio laser e ripetere il processo per tutti i pozzi.
In una cappa di coltura cellulare, utilizzare un raschietto cellulare per trasferire le cellule da ogni pozzo in singoli tubi conici da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 1.200 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 100 microlitri di tampone di lisi RIPA.
Trasferire le celle su singoli tubi in polipropilene da 1,2 millilitri. Flash congelare tutti i campioni in azoto liquido e metterli in un congelatore meno 80 gradi fino all'uso. Per localizzare le modifiche FPOP, analizzare il lisato cellulare digerito utilizzando l'analisi della spettrometria di massa tandem della cromatografia liquida, quindi calcolare l'entità della modifica.
Per confermare che le condizioni dell'incubatore della piattaforma sono sufficienti per la coltura cellulare sulla piattaforma laser, GCaMP2 è stato transiently trasfetto in HEK293T e l'efficienza di trasfezione per entrambe le piastre è stata valutata tramite imaging a fluorescenza. Un saggio di luciferasi è stato eseguito per quantificare l'efficienza di trasfezione. Le modifiche FPOP nelle celle HEK293T etichettate nel sistema di flusso sono state confrontate con quelle etichettate nell'incubatore di piattaforme.
L'incubatore di piattaforme ha sovraperformato il sistema di flusso sia nel numero di proteine modificate che nella copertura FPOP totale in quelle proteine. Nel sistema di flusso sono stati rilevati due peptidi modificati, fornendo informazioni strutturali limitate. Tuttavia, nell'incubatore della piattaforma sono stati rilevati cinque peptidi modificati che coprono la sequenza di actina.
Qui sono mostrati spettri MS tandem di actina con prolina modificata in entrambi i sistemi e peptide actino non modificato. I residui modificati FPOP nei campioni dell'incubatore della piattaforma contenevano 12 residui modificati, tre residui modificati nel sistema di flusso e un residuo modificato sovrapposto. L'analisi LC-MS MS ha rivelato che 792 proteine sono state modificate da FPOP in vivo nell'incubatore di piattaforme rispetto alle 545 proteine modificate con il sistema di flusso.
È imperativo mantenere le cellule in condizioni sterili. Portare sempre l'incubatore di piattaforme nel cappuccio sterile per la coltura cellulare per inserire tutte le piastre, i tubi e gli anelli necessari a sei poggiase. Ciò garantisce l'integrità dell'esperimento.
