Questo metodo fornisce ai ricercatori un nuovo modo per preparare le radici delle piante acquatiche, la rizosfera circostante e il terreno sfuso per le tecniche di imaging elementare. Il vantaggio principale di questo metodo è che è relativamente veloce e conveniente, preservando accuratamente la distribuzione e la speciazione degli elementi di interesse. Questa tecnica può essere utilizzata per rispondere a domande riguardanti molti elementi e sistemi vegetali, dai nutrienti nei sistemi agricoli al destino e al trasporto di contaminanti nei sistemi di fettezzazione.
Assicurati di lavorare rapidamente e allo stesso tempo di essere consapevole dell'area o delle aree desiderate del sistema radicale per il campionamento. E prendi più campioni per sistema di root. Per preparare l'apparecchiatura di congelamento slam per un esperimento, posizionare due, cinque per cinque per 15 centimetri blocchi di rame orizzontalmente in un dispositivo di raffreddamento pulito in grado di contenere azoto liquido.
E indossando i DPI appropriati, versare abbastanza azoto liquido nel dispositivo di raffreddamento per immergere i blocchi. Una volta che il gorgogliamento si attenua, posizionare un distanziatore su ciascuna estremità di un blocco di rame. Quindi, usando pinze e guanti criogenici, posiziona l'altro blog di rame alla sua estremità per facilitare il recupero quando il campione è a posto.
Per raccogliere il campione, utilizzare una pianta in vaso o utilizzare una pala per iniziare a estrarre la pianta e la rizosfera desiderate dal terreno umido, facendo attenzione che il foro scavato sia molto più grande del volume di radice desiderato. Utilizzare una lama d'acciaio per tagliare via il terreno in eccesso, facendo attenzione a non disturbare il terreno all'interno dell'area desiderata. Quando le aree desiderate raggiungono, tagliare un cubo di radice di circa tre per tre per due centimetri e posizionare immediatamente il cubo tra i due distanziali sul blocco di rame orizzontale.
Per uno slam congelamento del campione, utilizzare i guanti criogenici per posizionare il blocco di rame verticale sui distanziatori per circa cinque minuti. Quando il gorgogliamento si attenua, trasferire il campione di cubo di rizosfera congelato in un pezzo di foglio di alluminio pre-etichettato quadrato. Per congelare i cubetti di terreno, quando il liofilizzatore ha raggiunto la pressione e la temperatura del vuoto corrette, posizionare un campione di cubo di rizosfera congelato per un tubo da 50 millilitri pulito e lavato con acido o direttamente nel liofilizzatore e utilizzare una salvietta monouso pulita per evitare che la polvere penetri nella pompa per vuoto.
Posizionare i campioni nel recipiente del liofilizzatore per almeno alcuni giorni fino a quando non si asciugano. Quando i tessuti sono stati liofilizzati, utilizzare una lama d'acciaio per asciugare i cubetti di terreno a una dimensione appropriata per l'analisi prima di posizionare i cubi in forme etichettate all'interno di un essiccatore sottovuoto. Dopo aver preparato la resina epossidica secondo le istruzioni del produttore, utilizzare un contagocce per aggiungere lentamente resina epossidica alla forma su un lato del terreno, fino a quando la resina epossidica copre interamente il campione.
Il terreno si scurisce di colore mentre la resina epossidica bagna il terreno. Una volta riempite le forme con resina epossidica, chiudere l'essiccatore e accendere il vuoto. Controllare il livello di una resina epossidica ogni 30-90 minuti per la prima o quattro ore, aggiungendo ulteriore resina epossidica se necessario.
Una volta che la resina epossidica si è indurita, rimuovere il campione. Dopo l'incorporamento, utilizzare una sega a umido di precisione a lama diamantata per tagliare il campione. Tagliare il campione in una direzione diversa se non si ottengono radici nel taglio precedente.
Dopo il taglio, carteggiare manualmente il lato tagliato di ciascun campione con carta vetrata progressivamente più fine per 30 secondi per graniglia. In questa figura, diversi diametri delle radici possono essere osservati all'interno della matrice del suolo come sezioni trasversali. Le radici possono dimostrare diversi livelli di qualità.
Ad esempio, in questa immagine, si possono osservare una radice ben conservata, una radice distorta dal processo di liofilizzazione e una radice che è stata estratta durante il processo di sezionamento sottile. L'analisi di questa sezione trasversale della radice con una radice laterale in sezione longitudinale mediante imaging a fluorescenza a raggi X di sincrotrone come dimostrato consente il rilevamento di ferro, manganese e arsenico. La presenza di ferro all'interno del terreno e che circonda la radice nella placca di ferro è visibile anche nelle immagini micrografiche luminose.
Il manganese è presente in modo univoco all'interno della corteccia della radice laterale, ma co-localizza anche con il ferro in alcune aree all'interno della placca di ferro come una tonalità verde-blu. L'arsenico si trova principalmente all'interno della vascolarizzazione della radice laterale che si fonde nella vascolarizzazione della radice primaria. L'imaging di speciazione chimica rivela una variabilità nella localizzazione delle specie di arsenico.
Come osservato in questa trama tricolore, l'arsenite e l'arsenite glutatione sono strettamente associati nella vascolarizzazione, mentre l'arseniato si localizza principalmente all'interno dell'esterno della radice, associato alla placca di ferro. Prima della raccolta dei campioni, determinare la parte desiderata del sistema radice per l'imaging elementare. Questo determinerà l'orientamento della posizione della chiave radice rimossa.
Seguendo questo protocollo, i campioni possono essere ripresi su scala micron o più grossolani utilizzando una varietà di tecniche, a seconda delle domande di ricerca specifiche, degli elementi di interesse o della strumentazione disponibile.
