Il nostro protocollo facilita la formulazione di idrogel polimerico-nanoparticelle per l'uso come biomateriali. Speriamo che i ricercatori sviluppino questo materiale per applicazioni trasizionali ed esploreranno le questioni biologiche di base. Gli idrogel PNP vengono facilmente iniettati attraverso aghi e cateteri di piccolo diametro, ma si auto-guariscono rapidamente dopo l'iniezione.
Ciò consente la somministrazione controllata non invasiva di farmaci e cellule su lunghi tempi. Questa tecnologia spinge i confini per la terapia localizzata e l'esteso rilascio di farmaci, con implicazioni per ampie condizioni di rabbia dal cancro alla rigenerazione tissutale fino all'immunizzazione passiva. Per sintetizzare le nanoparticelle mediante nano precipitazione, aggiungere 50 milligrammi di polimero PEG-PLA a un flaconcino a scintillazione di vetro da otto millilitri e aggiungere un millilitro di acetonitrile al flaconcino.
Vortice da sciogliere completamente. Aggiungere quindi 10 millilitri di acqua ultra pura a una fiala a scintillazione in vetro da 20 millilitri con una piccola barra di agitazione e posizionare il flaconcino su una piastra di agitazione impostata su 600 giri al minuto. Utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aggiungere un millilitro della soluzione di solvente polimerico dropwise al flaconcino dell'acqua.
Le nanoparticelle del guscio centrale si formeranno poiché la soluzione di solvente polimerico viene rapidamente dispersa in tutta l'acqua. Verificare la dimensione delle particelle mediante scattering dinamico della luce secondo protocolli standard. Quindi trasferire la soluzione di nanoparticelle in un'unità filtrante centrifuga per concentrare la soluzione a meno di 250 microlitri e rimorsire le nanoparticelle in un buffer appropriato.
Per preparare l'idrogel, aggiungere 333 milligrammi di soluzione stock HPMC-C12 al 6%HPMC-C12 a una siringa di blocco Luer millilitro e aggiungere 500 microlitri della soluzione di stock di nanoparticelle del 20% e 167 microlitri di PBS a un flaconcino da otto millilitri. Dopo la miscelazione, utilizzare un ago per riempire un'altra siringa di blocco Luer millilitro con la soluzione di nanoparticelle diluita e attaccare le due siringhe a un mixer a gomito. Mescolare le due soluzioni per circa 60 cicli fino a formare un materiale idrogel bianco omogeneo e opaco.
Per misurare le proprietà reologiche dell'idrogel formulato, iniettare il volume appropriato di idrogel in base allo spazio geometrico selezionato al centro di una piastra reometrica seghettata e utilizzare prove oscillatorie e di flusso per misurare le proprietà meccaniche del campione. Per caratterizzare il rilascio di farmaci dall'idrogel, in primo luogo, preparare un capillare di vetro utilizzando epossidico per sigillare un'estremità di ogni tubo. Quando l'epossidico si è impostato, utilizzare un ago ipodermico da 22 pollici da quattro pollici per iniettare da 100 a 200 microlitri di idrogel in un minimo di tre tubi per campione e aggiungere con cura da 200 a 300 microlitri di PBS su ogni volume di idrogel.
Nei punti di tempo appropriati, in base alla tempistica prevista per il rilascio del farmaco, utilizzare un ago per rimuovere con cura il PBS da ogni capillare senza disturbare la superficie dell'idrogel e aggiungere un nuovo volume di PBS. Al termine dello studio, analizzare le aliquote PBS raccolte con un metodo appropriato per quantificare la quantità di farmaco rilasciato in ogni momento. Per caratterizzare la stabilità termica dell'insulina incapsulata in gel, caricare sia l'insulina che la tioflavina T nell'idrogel come dimostrato e utilizzare un ago calibro 21 per iniettare 200 microlitri del carico e sondare l'idrogel caricato in almeno tre pozzi di una piastra nera da 96 pozzetti per campione.
Quindi sigillare la piastra con una guarnizione della piastra adesiva otticamente chiara per evitare l'evaporazione e inserire la piastra in un lettore di piastre dotato di controllo della temperatura, agitazione e una programmazione di lettura cinetica. Per valutare la vitalità delle cellule incapsulate da idrogel, utilizzare un ago calibro 21 per iniettare 150 microlitri di idrogel contenenti l'appropriata concentrazione di cellule in ciascuno dei tre pozzali per campione in una piastra chiara inferiore di 96 porci e aggiungere 100 microlitri del mezzo cellulare appropriato in ogni volume di idrogel. Il primo giorno di coltura, sostituire il supernatante su ogni idrogel nel momento appropriato per ogni gruppo campione con 50 microlitri di due millimolare calcein AM soluzione.
Dopo un'incubazione di 30 minuti, immagini il centro di ogni pozzo con microscopia confocale. Per valutare la capacità delle cellule incapsulate di depositarsi in una siringa prima dell'iniezione, diluire le cellule di interesse a una volta 10 per le sei cellule per millilitro nella concentrazione di PBS e macchiare le cellule con 50 microlitri di due millimolare Calcein AM per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, mescolare le cellule con da 500 a 700 microlitri di idrogel come dimostrato e utilizzare un ago calibro 21 per iniettare da 100 a 200 microlitri di cellule contenenti idrogel nel fondo di almeno una cuvetta per campione.
Quindi immagini le cuvette sdraiate piatte sui loro lati sul palco di un microscopio confocale immediatamente dopo l'iniezione e a una e quattro ore dalla semina per osservare se le cellule si sono depositate nell'idrogel o se sono rimaste sospese. Le capacità di assottigliamento a taglio e auto-guarigione del gel possono essere osservate utilizzando rispettivamente protocolli di sweep di flusso e step-shear. La caratterizzazione dei moduli di stoccaggio e perdita utilizzando un esperimento di sweep di frequenza di taglio oscillatorio nel regime viscoelastico lineare a frequenza varia da 0,1 a 100 radianti al secondo rivela le proprietà solide.
In genere non dovrebbe esserci un crossover dei moduli di stoccaggio e perdita di taglio osservati a basse frequenze per formulazioni più rigide, mentre ci si può aspettare eventi crossover per formulazioni idrogel più deboli. Variare il contenuto polimerico degli idrogel PNP può avere un impatto diretto sulla diffusione del carico attraverso la rete polimerica e sulla velocità di rilascio dai materiali. Gli idrogel PNP possono anche stabilizzare il carico suscettibile all'instabilità termica, prolungando notevolmente la durata di conservazione del carico e riducendo la dipendenza dallo stoccaggio e dalla distribuzione della catena del freddo.
L'inclusione di motivi integrina può essere utile per adattare idrogel PNP per terapie cellulari. Le celle incapsulate possono essere etichettate fluorescentmente per facilitarne la visualizzazione e la quantificazione. Ad esempio, le formulazioni prive di siti di adesione avranno una bassa vitalità cellulare in quanto le cellule incapsulate non riescono a proliferare rispetto alle cellule incapsulate e alle formulazioni con motivi di adesione, come RGD.
Stiamo ancora esplorando come i cambiamenti nella formulazione influenzino le caratteristiche reologiche e la mesh dinamica della matrice polimerica. Usiamo anche FRAP per studiare la diffusione delle molecole all'interno dell'idrogel. Questi materiali possono essere utilizzati per porre nuove domande biologiche su come il parto prolungato potrebbe influenzare il parto dei farmaci, lo sviluppo di vaccini o l'immunoterapia del cancro.
