Lo sviluppo di nuove terapie per le metastasi del SNC è stato ostacolato dalla mancanza di buoni modelli preclinici. I nostri modelli di xenotrapianto derivati dal paziente ricapitolano le metastasi del SNC meglio dei modelli di linee cellulari storicamente utilizzati. Utilizzando diverse vie di inoculazione del tumore, è possibile studiare diversi aspetti della cascata metastatica.
Ogni percorso ha vantaggi che possono essere sfruttati per il tuo studio. A dimostrare la procedura sarà Ben Yi Tew, un borsista post-dottorato del mio laboratorio. Per l'impianto sottocutaneo del fianco di tumori PDX crioconservati, scongelare rapidamente il tessuto tumorale crioconservato in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Quindi, sciacquarlo in cinque millilitri di DPBS in un piatto di coltura tissutale. Successivamente, dopo aver confermato l'anestesia in un topo NOG femmina di tre-otto settimane, praticare un'incisione da 0,5 a un centimetro sul fianco sinistro o destro e inserire un pezzo di 2x2x2 millimetri del tessuto tumorale profondamente nella tasca. Dopo aver chiuso l'incisione, consentire al topo di riprendersi dall'anestesia con monitoraggio fino a quando non è ambulatoriale.
Una volta che il tumore inizia a crescere, misurare il tumore tre volte alla settimana con un calibro. All'endpoint sperimentale appropriato, identificare le metastasi attraverso una necroscopia e confermare la presenza di tumori all'interno dell'organo bersaglio attraverso un'analisi istologica. Posizionare il tumore PDX resecato in DMEM sul ghiaccio.
Lavare il tumore in cinque millilitri di DPBS in un piatto di coltura tissutale e rimuovere le regioni necrotiche se ce ne sono. Tagliare il tumore in piccoli pezzi da due a quattro millimetri di lunghezza e trasferire i pezzi in un tubo contenente soluzione di dissociazione. Utilizzando il programma appropriato su un dissociatore, dissociare meccanicamente il tessuto e deformare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare di 70 micrometri.
Utilizzare 20 millilitri di DMEM per lavare eventuali cellule rimanenti dal filtro e centrifugare la sospensione cellulare dissociata. Quindi, risospendere le cellule e DPBS per il conteggio e regolare le cellule a una concentrazione da cinque a 10 volte 10 alle quarte cellule per uno o due microlitri di DPBS. Per preparare l'area chirurgica, radere la pelliccia sulla testa del topo per esporre il cuoio capelluto.
Quindi, posizionare il mouse in una cornice stereotassica, fissando saldamente la testa del mouse usando le barre auricolari. Assicurati di somministrare anche un analgesico appropriato. Disinfettare il cuoio capelluto con tre scrub alternati di povidone-iodio e etanolo al 70%.
Fai un'incisione longitudinale da cinque a sette millimetri per esporre il cranio e ritrarre il cuoio capelluto. Raschia via il periostio con una pinza per localizzare il bregma. Posizionare l'ago del fotogramma stereotassico sopra il bregma e azzerare le coordinate.
Sposta il braccio di un millimetro indietro e di un millimetro lateralmente a destra della linea mediana e contrassegna questa posizione con un pennarello permanente. Quindi, praticare un piccolo foro di bava nel cranio nella posizione contrassegnata, facendo attenzione a non perforare il cervello. Caricare a cinque microlitri siringa Hamilton calibro 26 con uno o due microlitri di cellule e collegare la siringa al braccio stereotassico.
Inserire lentamente l'ago di due millimetri nel cervello e iniziare a iniettare cellule alla velocità desiderata. Quando tutte le cellule sono state consegnate, ritrarre lentamente l'ago, riempire il foro di bava con cera ossea e chiudere l'incisione. Rimettere il mouse nella sua gabbia con il monitoraggio fino al recupero dall'anestesia.
Dopo l'eutanasia dell'animale all'endpoint sperimentale appropriato, confermare la presenza di tumori nel cervello attraverso un'analisi istologica. Per impiantare i tumori PDX mediante iniezione intracardiaca, preparare le cellule tumorali come dimostrato e posizionare il topo ricevente anestetizzato in posizione supina. Rasare la pelliccia sul petto dell'animale e disinfettare la pelle esposta con povidone-iodio e etanolo al 70%.
Aspirare da 0,5 a 10 volte 10 alle quinte cellule tumorali e fino a 100 microlitri di DPBS in una siringa dotata di un ago da 28 gauge. Individuare il sito di iniezione leggermente a sinistra dello sterno a metà strada tra la tacca sternale e il processo xifoideo. Quindi, inserire l'ago verticalmente nel mouse nel sito di iniezione.
Una volta osservato il riflusso, che indica un ingresso riuscito dell'ago nel ventricolo sinistro, erogare lentamente la sospensione tumorale nel ventricolo sinistro senza muovere l'ago. Quando tutte le cellule sono state consegnate, ritrarre lentamente e verticalmente l'ago e applicare un pezzo di garza sterile al sito di iniezione per circa un minuto fino a quando l'emorragia si ferma. Consentire al mouse di recuperare su un pad riscaldato con monitoraggio fino a quando non è ambulatoriale.
All'endpoint sperimentale appropriato, identificare le metastasi attraverso una necroscopia e confermare la presenza di tumori all'interno dell'organo bersaglio attraverso un'analisi istologica. Nonostante le differenze nel microambiente tumorale, i tumori PDX mostrano morfologie simili contenenti cellule con piccoli nuclei e scarso citoplasma, indipendentemente dal sito di impianto. In questa analisi, l'iniezione intracardiaca di cellule di melanoma umano ha provocato metastasi delle cellule tumorali al cervello del topo, mentre l'iniezione intracardiaca di cellule tumorali umane del polmone a piccole cellule che metastatizzano il cervello ha provocato metastasi alla cavità addominale e al fegato del topo.
Questi protocolli consentono l'impostazione di studi preclinici per testare nuovi trattamenti e combinazioni di trattamento e possono aiutare nello studio dei processi biologici e delle metastasi tumorali.
