Il protocollo qui descritto ha lo scopo di dimostrare un algoritmo per testare l'efficacia del trattamento utilizzando modelli di cancro in vivo. Il protocollo consiste in una combinazione di diverse tecniche. Il bio-sequenziamento dell'intero genoma dei campioni di tumore umano viene utilizzato per identificare le alterazioni genomiche.
Questi includono sia riarrangiamenti genico che cambiamenti del numero di copia genica. Quindi l'analisi delle alterazioni identificate viene eseguita al fine di selezionare cambiamenti potenzialmente drogabili. I farmaci selezionati sulla base dell'analisi genomica vengono quindi utilizzati per il trattamento in vivo di tumori corrispondenti coltivati in topi immunocompro compromessi.
L'algoritmo sviluppato rappresenta un approccio promettente per aiutare le decisioni di trattamento per la cura dei pazienti oncologici. Utilizzare lo strumento Panda o un software analogo per identificare le alterazioni indirizzabili. Possiamo elencare i geni identificati dal microsequenza risultanti come un semplice file delineato a schede usando simboli genetici accettati standard.
Aggiungere il cancello alla riga di intestazione dell'elenco per assicurarsi che l'intestazione della tabella venga trasferita al livello di percorso U del software. Caricare il file facendo clic sulla scheda di spostamento corrispondente. Assegnare una singola icona per rappresentare i dati sottostanti facendo clic sull'icona di scelta e quindi facendo clic sulla scheda finalizza.
Una volta caricati i file di un paziente, visualizzare in anteprima la pagina per identificare una colonna che visualizza il numero di geni annotati per percorso. Questa è l'ultima colonna a destra. Utilizzare un filtro percorso in alto a sinistra della finestra principale per limitare il numero di percorsi visualizzati a quelli che contengono i geni di interesse.
Per identificare le vie con più geni annotati di quanto ci si aspetterebbe per caso, utilizzare una funzione situata sotto la scheda di arricchimento. Una colonna viene quindi aggiunta alla tabella principale che mostra il valore p corrispondente dal test esatto di un Fisher. Selezionare il database per visualizzare potenziali geni drogabili dall'annotazione preimpostata controllando un'icona appropriata a sinistra della finestra principale.
Per selezionare un percorso per la visualizzazione, fare clic sul relativo nome visualizzato nella pagina visualizzatore percorsi. Le icone che rappresentano ogni gruppo di annotazioni vengono visualizzate accanto al gene associato. Cliccando su qualsiasi gene nel percorso si aprirà la corrispondente pagina delle schede geniche.
Selezionare le vie che hanno mostrato geni di interesse annotati e colpi per potenziali farmaci per ulteriori analisi. Eseguire il lavoro tissutale in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni sterili. Posare il tessuto tumorale in un piatto contenente PBS freddo o mezzi di coltura tissutale, come RPMI, DMEM, contenenti antibiotici.
Identificare e isolare materiale tumorale vitale dal tessuto normale e necrotico adiacente con l'aiuto di un patologo. Utilizzare forcep sterili e bisturi per rimuovere il materiale necrotico sottolineato da un patologo. Per eseguire l'innesto sottocutaneo, tagliare il tessuto tumorale con forcelle sterili, bisturi o forbici chirurgiche in piccoli frammenti, di dimensioni di circa 2 x 2 x 2 millimetri.
Trasferire il tessuto frammentato in una piastra di petri pre-refrigerata sul ghiaccio. Lasciare il matrigel freddo nel piatto con il tessuto frammentato, circa 200 microlitri per 10 pezzi di tessuto. Mescolare bene e lasciare che i frammenti di tessuto ammollo nel matrigel per 10 minuti.
Usa forbici chirurgiche sterili e forcep per fare un'incisione verticale della pelle di 5-10 millimetri su entrambi i fianchi di un topo. Inserire delicatamente le forcette dritte nello spazio sottocutaneo per creare una tasca abbastanza grande da poter posizionare un frammento di tumore sotto il cuscinetto grasso. Utilizzare forcep dritte sterili per inserire frammenti di tumore nella tasca precedentemente preparata in ciascuno dei cinque topi.
Chiudere l'incisione cutanea usando la colla tissutale. Dopo l'impianto, per inibire la proliferazione dei linfociti, iniettare ogni topo con 100 microlitri di rituximab. Preparare il topo per il gavage orale pizzicando la pelle della schiena e piegarla all'indietro in modo che la testa e le labbra del mouse siano immobilizzate.
Inserire la sonda di gavage nella parte posteriore della gola del mouse fino a quando la sonda raggiunge l'esofago. Assicurarsi che la sonda non sia inserita troppo lontano in quanto i polmoni del topo possono perforare causando la morte. Il galleggiante rappresentativo del genoma illustra il paesaggio dei cambiamenti genomici in un tumore.
Tipici dei tumori sierosotipi di alto livello, delle linee blu a plusvalenze e delle perdite di linee rosse, sono stati identificati indicando alti livelli di instabilità genomica. La principale alterazione di tendenza per l'intervento terapeutico nel tumore OC101 è stata un'amplificazione al cromosoma 17, che ha coinvolto ERBB2, un gene che codifica per il recettore HER2. Per convalidare i risultati a livello di DNA, diversi set di primer specifici sono stati progettati per i bordi della regione amplificata.
E la PCR è stata effettuata. Nessun prodotto di amplificazione è stato assorbito quando è stato utilizzato il DNA umano di controllo. Sono state identificate bande specifiche per il DNA tumorale OC101.
In un'altra variante tumorale, T14, sono stati osservati numerosi guadagni di DNA. Questi includevano AKT2 nei geni RICTOR. La convalida effettuata a livello proteico, utilizzando l'immunoblotting, ha mostrato alti livelli di AKT in RICTOR.
Una significativa riduzione del carico tumorale è stata osservata nel gruppo trattato con chemioterapia entro la fine della settimana sei. C'è stato un vantaggio in più rispetto alla sola chemioterapia nei gruppi che hanno ricevuto un trattamento combinato. Il tessuto tumorale è stato raccolto per l'analisi molecolare della risposta al trattamento alla fine dello studio di trattamento.
I livelli totali e fosforilati di S6, AKT e mTOR sono stati determinati utilizzando l'immunoblotting. Il confronto dei livelli di queste proteine in inibitori non trattati, trattati con chemioterapia e trattati con AKT o mTOR inhibitor ha mostrato una marcata diminuzione per gli ultimi due. L'approccio presentato è molto utile per condurre lo studio clinico nei modelli PDX.
Sfrutta le caratteristiche molecolari del tumore ottenute dalla profilazione genomica per determinare la scelta migliore dei farmaci per i test.
