Qui presentiamo protocolli migliorati per preparare campioni crio-EM con film di supporto utilizzando un nuovo blocco di flottazione che facilita la gestione di film così delicati. Il vantaggio principale di questo metodo è che il campione è protetto dall'interfaccia aria-acqua dove possono verificarsi effetti dannosi come la denaturazione. Uno dei protocolli qui presentati evita qualsiasi tipo di trattamento costoso per rendere idrofilo il grafico, aumentando così la sua accessibilità a tutta la comunità EM.
I piccoli dispositivi di flottazione non sono ancora ampiamente utilizzati dall'elettromicroscopia per una buona preparazione. Quindi queste dimostrazioni visive possono fornire un punto di riferimento per il loro utilizzo. Per iniziare, lavare le griglie TEM con acqua a doppio distillato e acetato di etel seguito da pulizia al plasma.
Quindi aggiungere da 10 a 12 microlitri del campione nel pozzo di scambio tampone, il blocco di flottazione e da 10 a 12 microlitri di soluzione di acetato urinario al 2% nel pozzo di scambio non tampone adiacente per la colorazione negativa. È essenziale prendere le opportune precauzioni di sicurezza quando si lavora con la macchia. Tagliare con cura due piccoli pezzi di mica con film di carbonio predepositato sulla parte superiore.
Assicurarsi che i frammenti di mica siano abbastanza larghi da adattarsi al pozzo e più lunghi della lunghezza del pozzo, in modo tale che il frammento possa sedersi sul pozzo mentre il carbonio galleggia e c'è abbastanza spazio per gestire il frammento con le pinzette. Immergere la mica nel pozzo con un angolo approssimativo di 45 gradi fino a quando la mica si trova sulla rampa del pozzo e lo strato di carbonio viene osservato sulla superficie del campione liquido. Dopo aver incubato il carbonio con il campione, prelevare il foglio di mica molto lentamente per recuperare il film di carbonio e ridurre al minimo la ritenzione residua del campione di viscus.
Asciugare accuratamente la mica picchiettando la superficie inferiore non carbon con una carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso e immergere il frammento di mica nel pozzetto opposto contenente una soluzione di acetato di orinatoio al 2% per scambiare lo strato di carbonio con la macchia negativa. Recupera lo strato di carbonio galleggiante con il lato sacro coperto di carbonio della griglia EM lavata e pulita al plasma. Quindi lasciare asciugare le griglie all'aria fino all'imaging sul TEM, preferibilmente coprendole per evitare la contaminazione nell'aria.
Dopo aver pulito le griglie TEM come precedentemente dimostrato, preparare la sospensione di ossido di grafene appena prima dell'uso e vortice accuratamente. Quindi aggiungere da 10 a 12 microlitri di sospensione di ossido di grafene nei quattro pozzetti di scambio non tampone. lungo il blocco di flottazione.
Aggiungere da 10 a 12 microlitri di acqua distillata doppia o acqua ultra pura nei restanti quattro pozzetti di scambio tampone del blocco. Far cadere delicatamente quattro griglie sulla sospensione di ossido di grafene di ciascun pozzetto e incubare per un minuto per assicurarsi che il lato sacro coperto di carbonio sia a contatto con la soluzione. Dopo un minuto, recuperare attentamente ogni griglia facendo scorrere le pinzette nella scanalatura della pinzetta di ogni pozzo di scambio non tampone.
Spingere delicatamente e brevemente il lato coperto di rame non carbonio di ciascuna griglia con l'acqua doppia distillata nel pozzo adiacente fino a quando la goccia d'acqua è visibile sulla griglia. Quindi tenere con attenzione la goccia d'acqua della griglia a testa in giù contro un pezzo di carta da filtro. Coprire le griglie e lasciarle asciugare all'aria nelle pinzette.
Posizionare quattro griglie di lavaggio sopra un foglio grafico di rame depositato su una diapositiva di vetro e coprire ogni griglia con una goccia di isopropanolo per consentire un contatto intimo tra il grafene monostrato e la griglia. Dopo la completa evaporazione dell'isopropanolo, far galleggiare il foglio di grafene di rame con griglie sulla soluzione di cloruro ferrico nella capsula di Petri di vetro. Quindi coprire il piatto per evitare la contaminazione nell'aria e lasciarlo incidere a temperatura ambiente durante la notte.
Utilizzare un anello con il diametro maggiore della dimensione della griglia TEM per pescare le griglie che galleggiano sul monostrato di grafene e trasferirle con cura in una capsula di Petri di vetro contenente acqua doppia distillata per il lavaggio. Lavare le griglie due volte in acqua e trasferire le griglie in una capsula di Petri contenente tampone campione fino alla preparazione del campione e al congelamento a immersione. Aggiungere da 10 a 12 microlitri del campione in un pozzetto del blocco di flottazione.
Quando il campione è pronto nel blocco, prelevare la griglia rivestita di grafene dalla soluzione tampone utilizzando un paio di pinzette pulite e posizionarla sulla superficie del campione contenente bene. Dopo un adeguato periodo di incubazione, raccogliere la griglia con un paio di pinzette di congelamento pulite e procedere con il blotting e la vetrificazione. Le griglie macchiate negativamente preparate con il blocco di flottazione di supporto sono in genere ricoperte di carbonio amorfo su tutta la superficie della griglia.
Mentre la rottura del film di carbonio si verifica in alcuni casi, un gran numero di quadrati della griglia sono incontaminati e quindi applicabili a scopi di colorazione negativa. Allo stesso modo, una buona copertura del film viene regolarmente raggiunta su tutta la griglia utilizzando il protocollo dell'ossido di grafene. Le griglie di ossido di grafene possono essere preparate rapidamente dalle materie prime e sono altamente protettive del campione.
Mantenere il grafene bagnato e l'applicazione del campione in situ appena prima del congelamento è sufficiente per generare strati di ghiaccio adatti per la crio-EM. Questo protocollo non richiede apparecchiature per rendere idrofilo il grafene e offre un vantaggio per il recupero del campione. Il blocco di flottazione di supporto ha due porte dell'ago nel sito di ciascun pozzetto che consentono l'estensione del tampone in C2, il che è molto utile per i campioni derivati da gradienti di glicerolo.
Il blocco di flottazione ha permesso l'esplorazione di metodi di purificazione dell'affinità su griglia utilizzando un flusso tampone controllabile di piccoli volumi e film di supporto funzionalizzati.
