Qualsiasi progetto di scienze biologiche che richieda l'indagine dell'ultrastruttura 3D su una specifica regione di interesse in un campione biologico complesso può utilizzare questa tecnica. La procedura di preparazione del campione è la stessa per due modalità di imaging: SBF/SEM e FIB-SEM. L'uso del microonde accelera notevolmente la parte di elaborazione del campione.
Sebbene mostrato qui per le punte delle radici, questo protocollo può essere utilizzato per qualsiasi sistema di modelli biologici con regolazioni minime. Prima di utilizzare questo flusso di lavoro per correlare SBF/SEM e FIB-SEM, è necessario avere familiarità con le singole tecnologie. L'esecuzione di determinati passaggi è facilmente dimostrabile ma difficile da descrivere nel testo scritto.
A dimostrare la procedura sarà Peter Borghgraef che è un tecnico nel nostro laboratorio. Per iniziare, tagliare le punte delle radici delle piantine fisse arabidopsis thaliana su piastre di agar e mettere da due a tre punte in tubi Eppendorf contenenti lo stesso fissativo durante la notte a quattro gradi Celsius. Al mattino, con una pipetta, sostituire fissatore con tampone fosfato molare 0,1 a pH 6,8 nei tubi con i tubi su un tavolo rotante a 100 giri/min e lavare per 10 minuti.
Quindi ripetere il lavaggio utilizzando tampone di fosfato fresco cinque volte. In una cappa aspirante, post-fissare le punte delle radici sostituendo il tampone fosfato con il 2%di tetrossido di osmio e lo 0,2% rosso rutenio in tampone fosfato molare 0,1 a pH 6,8 con i tubi con coperchi aperti in un forno a microonde e avviare il programma. Quindi scartare la soluzione nei tubi e lavare le punte delle radici due volte con acqua distillata doppia per cinque minuti ciascuna.
Per il terzo e quarto lavaggio dell'acqua distillato doppio, utilizzare il microonde per assistere il lavaggio. Dopo il primo lavaggio dell'acqua distillato doppio di 40 secondi, prelevare i campioni della punta della radice dal microonde e sostituire l'acqua doppia distillata con acqua fresca doppia distillata. Rimettete i campioni nel microonde e continuate il programma.
Quindi, preparare la soluzione TCH aggiungendo 0,1 grammi di tiocarboidrazide a 10 millilitri di acqua distillata doppia in un tubo da 15 millilitri. Posizionare il tubo in un forno e riscaldare a 60 gradi Celsius per un'ora per dissolversi. Quindi filtrare la soluzione TCH utilizzando un filtro siringa da 0,22 micrometri.
Sostituire immediatamente la soluzione nei tubi campione con la soluzione TCH filtrata e continuare con il protocollo. Ora immergere i campioni in etanolo e metterli nel microonde per disidratarli in gradini graduati del 50%70%90% e poi due volte del trattamento con etanolo al 100%. Dopo il trattamento di disidratazione dell'ossido di propilene, aggiungere la resina di Spurr al 50% nei tubi per iniziare l'infiltrazione delle punte delle radici per un minimo di due ore.
Dopo l'incubazione finale nella resina 100%Spurr, posizionare le punte delle radici in stampi di incorporamento e riempire gli stampi con resina fresca 100% Spurr e polimerizzare in forno a 65 gradi Celsius per 36-48 ore. In primo luogo, utilizzare una lama di rasoio per tagliare approssimativamente il campione polimerizzato in un blocco sottile. Con il lato con tessuto esposto rivolto verso il basso, attaccare il campione al centro di un perno metallico con resina epossidica conduttiva per far toccare il tessuto al perno metallico.
Mettere il campione in forno a 65 gradi Celsius per curare l'epossidico durante la notte. Al mattino, caricare il perno metallico nel supporto e utilizzare una lama di rasoio per rimuovere eventuali epossidici in eccesso dal campione. Per lisciare ulteriormente la faccia del campione, caricare il supporto con il perno metallico nel supporto per l'ultramicrotoma.
Nell'ultramicrotoma, utilizzare un coltello di vetro o diamante per levigare la faccia dei lati del blocco formando una piramide. Assicurarsi che almeno parte del tessuto sia già esposto sulla faccia del blocco. Quindi posizionare il blocco campione tagliato nel rivestimento dello sputter e regolare le impostazioni sul platino a due o cinque nanometri per rivestire il campione con uno strato sottile.
Inserire il supporto nel microscopio SBF-SEM. Portare il coltello a diamante vicino alla superficie del campione e tagliare la parte superiore del campione per rimuovere lo strato di platino ed esporre parte del tessuto. Quindi impostare la tensione di accelerazione su 1,5 a 2 kilovolt.
Cattura un'immagine del tessuto e imposta una serie di immagini. Utilizzando il software Fiji, seleziona file, importa, sequenza di immagini e individua lo stack di immagini per caricare le immagini. Dopo aver regolato l'immagine in base al manoscritto, controllare l'allineamento scorrendo il set di dati.
Utilizzare il comando Salva nel menu file per salvare il set di dati allineato come file TIFF 3D. Analizza attentamente il set di dati per vedere se il ROI è incluso e contiene le informazioni necessarie per la domanda biologica. Nell'ultima immagine dello stack, che è la faccia del blocco corrente nel microscopio SBF-SEM, selezionare un nuovo ROI per FIB-SEM.
Dopo aver nuovamente rivestito con platino, caricare il campione nel FIB-SEM e utilizzare il rivelatore di elettroni secondario a 15 kilovolt e un nanoamp per localizzare il ROI identificato nello SBF-SEM sulla faccia del blocco. Spostare e inclinare il palco per portare il ROI sul campione nel punto di coincidenza delle travi FIB e SEM, utilizzando il sistema di iniezione di fascio e gas FIB. Depositare uno strato protettivo di platino di un micrometro sulla superficie sopra il ROI.
Successivamente, utilizzando una corrente di fresatura bassa che va da 50 a 100 picoamps, fresare linee sottili nella deposizione di platino per l'autofocus e il tracciamento 3D durante l'esecuzione dell'imaging. Quindi, utilizzando un'elevata corrente di fresatura di 30 nanoambi, fresare una trincea di 30 micrometri davanti al ROI creando la superficie di imaging per il fascio SEM. Dopo aver smussato la superficie dell'immagine, avviare l'esecuzione dell'imaging e monitorare la stabilità del processo durante le prime 50-100 sezioni.
Una volta che il sistema funziona senza intoppi, lasciare la stanza e assicurarsi che ci sia il meno disturbo possibile nella stanza. Le immagini dello SBF-SEM forniscono una panoramica del tessuto che fornisce informazioni sull'orientamento spaziale delle cellule e sulle connessioni intracellulari. La successiva imaging FIB-SEM su una nuova regione aggiunge dettagli ad alta risoluzione di celle e strutture specifiche.
I dati SBF-SEM mostrano un rendering diverso dei voxel non isotropi dai dati FIB-SEM voxel isotropici. SBF-SEM presenta un effetto scala sulla superficie mentre i dati FIB-SEM con le cinque sezioni nanometriche assicurano che il rendering appaia molto più fluido e che le singole sezioni si fondono completamente nella superficie. Questo protocollo descrive l'imaging di un'area univoca in un singolo campione e qualsiasi deviazione dal flusso di lavoro può causare danni al campione rendendo impossibile il posizionare l'area di interesse.
