La NMR quantitativa del fosforo rappresenta una delle scoperte più significative nella chimica analitica della lignina e del tannino negli ultimi tre decenni. Questa tecnica offre informazioni veloci, affidabili e quantitative per i vari gruppi idrossilici nel campione. Questi metodi NMR hanno un enorme valore nella comprensione della struttura dei lignani e dei tannini.
È stato anche applicato a una varietà di altri sistemi che hanno gruppi ossidrilici reattivi. Inizia pre-trattando 100 milligrammi del campione di lignina o tannino asciugando durante la notte in un forno sottovuoto a 40 gradi Celsius. Dopo l'essiccazione, trasferire rapidamente il campione in un essiccatore di solfato di calcio anidro fino a raggiungere la temperatura ambiente.
Per preparare il campione per la spettroscopia NMR, pesare accuratamente circa 30 milligrammi del campione in un flaconcino da due millilitro dotato di una barra di agitazione. Quindi, aggiungere 500 microlitri della soluzione solvente appena preparata al flaconcino del campione e sigillare il flaconcino con un tappo. Utilizzando una micropipetta, aggiungere 100 microlitri della soluzione standard interna al flaconcino del campione, quindi mescolare magneticamente la dispersione risultante a 500 rotazioni al minuto.
Quando il campione è completamente disciolto, trasferire 100 microlitri di tetrametil diossifosfolano o TMDP alla soluzione campione mentre si lavora sotto il cofano e sigillare la soluzione campione prima di posizionare il campione per una vigorosa agitazione magnetica. A questo punto, la reazione indicata avviene sui campioni di lignina e tannino. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire la soluzione campione in un tubo NMR per l'analisi.
Se nel campione si osserva un precipitato giallo, ripetere la procedura assicurandosi che venga evitata tutta la possibile contaminazione da umidità. Caricare la provetta campione nello strumento NMR dotato di una sonda a banda larga e impostare i parametri sperimentali. Utilizzando la frequenza di risonanza del cloroformio deuterato, impostare la frequenza nello spettrometro.
Shim il campione e sintonizzare lo spettrometro prima di iniziare l'acquisizione. Inizia a elaborare i dati grezzi dalla spettroscopia NMR P31 eseguendo la trasformazione di Fourier. Regola fase per correzione di fase manuale espandendo la scheda di elaborazione e selezionando la correzione di fase e la correzione manuale.
Correggere manualmente la linea di base impostando attentamente i punti zero dopo aver fatto clic sull'elaborazione e selezionando la correzione della linea di base e della linea di base multipunto. Per la calibrazione del segnale, impostare il segnale per l'acqua fosforilata al valore di spostamento chimico di 132,2 parti per milione aprendo la scheda di analisi, quindi selezionare riferimento nella scheda di riferimento. Per l'integrazione del segnale, aprire integral nel menu di analisi.
Per normalizzare l'integrazione, impostare lo standard interno su 1.0 facendo clic sul picco per selezionare modifica integrale e inserire il valore 1.00 nella scheda normalizzata, quindi eseguire l'integrazione dello spettro in base ai cambiamenti chimici riportati nel manoscritto. Utilizzare l'equazione per calcolare la concentrazione molare della soluzione standard interna, o IS, e utilizzare il valore calcolato per stimare la quantità equivalente del segnale specifico per grammo del campione. La quantificazione dello spettro di vari gruppi idrossilici in una lignina artigianale di legno tenero derivata con TMDP è stata registrata utilizzando lo spettrometro NMR da 300 megahertz e 700 megahertz.
Negli spettri NMR, picchi acuti e forti sono stati rilevati rispettivamente a 144 e 132 PPM a causa dello standard interno e dell'idrossilazione della TMD. I diversi segnali dei gruppi idrossi erano evidenti in tutti gli spettri quantitativi P31 NMR delle lignine. In uno spettro NMR quantitativo P31 di un campione di tannino derivato utilizzando TMDP, un segnale caratteristico proveniente dalle diverse unità alifatiche oh pirogallolo e catecolo era ben visibile.
Il confronto tra lo spettro NMR della lignina prima e post-ossidazione è stato registrato utilizzando uno spettrometro NMR da 300 megahertz che mostra la riduzione dell'intensità dei picchi dei gruppi idrossi. I passaggi cruciali sono quelli relativi all'essiccazione e alla ponderazione del campione e i parametri di elaborazione NMR da utilizzare. E, soprattutto, la fasatura degli spettri ottenuti.
Quando questo metodo è accoppiato con NMR bidimensionale e cromatografia a permeazione di gel, può emergere un quadro molto dettagliato dei polifenoli naturali, offrendo informazioni strutturali senza precedenti e nuove intuizioni.
