Lo Shuttle Box Assay traccia in modo riproducibile la progressione e il recupero del deterioramento cognitivo a seguito di un trauma da forza contundente o di qualsiasi altro tipo di lesione cerebrale nel pesce zebra. Lo Shuttle Box Assay consente una misurazione relativamente semplice, rapida e robusta dell'apprendimento associativo sia nella memoria a breve che a lungo termine nel pesce zebra. Per iniziare, prepara la Shuttle Box modificando una scatola di gel da 30,5 per 19 per 7,5 centimetri con un pezzo di plexiglass da 5 per 19 centimetri aggiunto su ciascun lato con un angolo di 45 gradi.
Quindi fai una linea che segna il punto a metà del serbatoio per valutare quando i pesci hanno attraversato il centro del serbatoio. Dopo aver aggiunto 800 millilitri di acqua di sistema alla Shuttle Box, posizionare due o tre pesci in un serbatoio contenente acqua di sistema. Lasciare il serbatoio nella stanza buia dove verrà eseguito lo Shuttle Box Assay.
Successivamente, nella stanza buia, posiziona un pesce al centro della Shuttle Box. Fissare il coperchio e collegare gli elettrodi a un alimentatore. Il pesce dovrebbe essere acclimatato al buio.
Spegni tutte le luci e acclimata il pesce allo Shuttle Box per 15 minuti. L'acclimatazione di successo può essere considerata quando il pesce esplora liberamente il serbatoio. Dopo aver acclimatato con successo il pesce, lucidare manualmente una torcia a lente rossa da 800 lumen a circa due centimetri dalla parete della scatola di gel sul lato occupato dal pesce.
Non iniziare una prova se il pesce riposa accanto al filo di platino. Fai brillare lo stimolo luminoso direttamente sul pesce e segui manualmente qualsiasi movimento laterale del pesce con la luce per garantire una visualizzazione continua dello stimolo. Continuare a fornire lo stimolo luminoso fino a quando non viene soddisfatta una delle seguenti condizioni per una prova riuscita o fallita.
Considera la prova di successo se il pesce attraversa il punto a metà del serbatoio entro 15 secondi dall'esposizione alla luce. Una volta che il pesce attraversa il punto intermedio, interrompere immediatamente lo stimolo luminoso. Se la prova non è riuscita, utilizzare un alimentatore per elettroforesi per applicare uno stimolo d'urto negativo di 20 millivolt a un ampere, alternando due secondi di accensione, due secondi di spegnimento per 15 secondi con un massimo di quattro urti o fino a quando il pesce non passa a metà strada della scatola.
Quindi terminare sia lo stimolo leggero che quello negativo. Prima del periodo di addestramento, assicurati un acclimatamento riuscito allo Shuttle Box lasciando il pesce in condizioni di oscurità per 15 minuti. Quindi far brillare manualmente una torcia a lente rossa da 800 lumen a circa due centimetri dalla parete della scatola di gel sul lato occupato dal pesce.
Fai brillare lo stimolo luminoso direttamente sul pesce e segui qualsiasi movimento laterale del pesce con la luce per garantire una visualizzazione continua dello stimolo. Mentre la luce splende sul pesce, applicare contemporaneamente lo stimolo d'urto avverso di 20 millivolt a un ampere, alternando due secondi di on, due secondi di spegnimento per 15 secondi con un massimo di quattro shock o fino a quando il pesce non passa a metà strada della scatola. Una volta raggiunto questo obiettivo, terminare la luce e lo stimolo avverso.
Ripetere l'operazione per 25 iterazioni. Al termine, lasciare al pesce un altro periodo di acclimatazione di 15 minuti in condizioni di oscurità. Durante il periodo di test iniziale, eseguire un acclimatamento riuscito nella Shuttle Box per 15 minuti, quindi applicare solo lo stimolo luminoso per un massimo di 15 secondi e registrare le risposte.
Considera la prova di successo se il pesce attraversa il punto intermedio della Shuttle Box entro 15 secondi dall'avvio dello stimolo luminoso e interrompi immediatamente lo stimolo luminoso quando il pesce attraversa il punto intermedio. Considera la prova come fallita se il pesce non attraversa il punto intermedio della Shuttle Box 15 secondi dopo aver avviato lo stimolo luminoso e interrompe lo stimolo luminoso dopo 15 secondi. Durante il test iniziale, non applicare uno stimolo avverso a seguito di un tentativo fallito.
Eseguire test della memoria a breve termine immediatamente dopo il periodo di test iniziale. Indurre lesioni cerebrali drammatiche e attendere un periodo di quattro ore prima del test. Quindi acclimatare il pesce nella Shuttle Box per 15 minuti.
Valuta la memoria a breve termine applicando solo lo stimolo luminoso per un massimo di 15 secondi e registra se il pesce attraversa il punto a metà strada della scatola prima che la luce sia spenta, considerata come prova superata, o non riesca ad attraversare il punto intermedio entro i 15 secondi considerati come prova fallita. Ripetere il passaggio precedente 25 volte con un periodo di riposo di 30 secondi tra ogni prova e registrare il numero di prove riuscite e fallite. Eseguire test della memoria a lungo termine quattro giorni dopo il test iniziale.
Indurre lesioni cerebrali traumatiche e attendere un periodo di quattro ore prima del test, quindi acclimatare il pesce nella Shuttle Box per 15 minuti. Valuta la memoria a lungo termine applicando solo lo stimolo luminoso per un massimo di 15 secondi e registra se il pesce attraversa il punto a metà strada della scatola prima che la luce sia spenta, considerata come prova superata o non riesca ad attraversare il punto intermedio entro i 15 secondi considerati come prova fallita. Ripeti quanto sopra 25 volte con un periodo di riposo di 30 secondi tra ogni prova e registra il numero di prove riuscite e fallite.
La panoramica didattica dei paradigmi di apprendimento e memoria per la valutazione cognitiva è mostrata qui. Il pesce non danneggiato a otto mesi, giovane adulto, 18 mesi, adulto di mezza età, e 24 mesi, adulto anziano, ha richiesto un numero simile di prove per imparare il comportamento di evitare il semaforo rosso. Dopo aver utilizzato il modello di lesione cerebrale traumatica da forza contundente grave, o STBI, il pesce di diverse età ha richiesto un numero simile di prove per padroneggiare il test da uno a cinque giorni dopo l'infortunio.
Il primo giorno successivo a STBI, i pesci di tutte le età hanno richiesto un numero simile di prove per apprendere il comportamento, che era significativamente maggiore rispetto ai controlli non danneggiati. Il pesce non danneggiato ha rapidamente padroneggiato la Shuttle Box, ottenendo cinque studi positivi consecutivi in circa 17 studi, mentre un giorno dopo una lieve lesione cerebrale, o un lieve TBI, i pesci mostrano un aumento significativo del numero di prove per apprendere il comportamento. Questo deficit è aumentato dopo due lievi TBI ed è stato ulteriormente elevato dopo tre lievi lesioni da TBI.
I pesci non danneggiati mostrano un leggero aumento della differenza percentuale degli studi di successo nella memoria immediata e nella memoria ritardata rispetto al periodo di test iniziale. A seguito di un singolo lieve TBI, i pesci hanno mostrato deficit di memoria significativi e immediati rispetto ai pesci non danneggiati. Questa tendenza è continuata con lesioni ripetute con deficit crescenti a seguito sia di due TBI lievi che di tre TBI lievi.
La tempistica degli stimoli avversi applicati è fondamentale. L'abbinamento degli stimoli avversi con la luce e la loro rimozione simultanea solidifica la loro associazione ed è cruciale per il paradigma. Il test consente una valutazione rapida o un complesso apprendimento associativo che può essere utilizzato per studiare lo sviluppo, l'invecchiamento e gli impatti ambientali sul deterioramento cognitivo.
