Riconosciamo Bloomington centri di stock per il ceppo mosca. Questo lavoro è stato sostenuto da assegno di ricerca dal BBSRC (BB / G008973 / 1).

1. Fly Preparazione <ol><li> Outcross tutti i mutanti, Gal4 / UAS ed altre linee con un ceppo di tipo selvatico, come CSw-, per almeno sei generazioni prima degli esperimenti comportamentali per il controllo di background genetico 26. </li><li> Crescere mosche su una farina di mais, lievito e melassa cibo dieta standard nell&#39;ambito di un ciclo luce-buio 00:12 ore a 25 ° C, a meno manipolazioni specifiche richiedono una temperatura diversa. <ol><li> Per determinare gli effetti di espressione del transgene: Usa 18 ° C per impedire l&#39;espressione di transgeni in (sistema TARGET) Gal4 Gal80 ts attraverso lo sviluppo e quindi spostare le mosche per un incubatore a 30 ° C 1-2 giorni prima che l&#39;esperimento comportamentale. Condurre l&#39;esperimento a 30 ° C per determinare gli effetti di espressione del transgene 3,4,6,7,14. </li><li> Per gli esperimenti che utilizzano i canali TRPA1-attivati ​​dal calore per stimolare i neuroni: Sollevare linea a 23 ° C, che è una temperatura notamantenere un canale inattivo, e poi passare a una camera comportamento a 30 ° C per attivare la TRPA1 esprimendo neuroni. </li><li> Per gli esperimenti che utilizzano temperature Shibire sensibile di bloccare l&#39;uscita sinaptica 11, 14,24: posteriore linea a 18 ° C e condurre test a 30 ° C. </li></ol></li><li> Raccogliere le mosche 1-2 giorni prima dell&#39;esperimento e le considero in gruppi di circa 25 sotto la luce di CO 2 l&#39;anestesia. Conservare le mosche almeno O / N in fiale alimentari (senza lievito) a 25 ° C (a meno manipolazioni specifiche necessarie una temperatura diversa) e umidità relativa del 70% in una stanza con la luce ambiente controllato 00:12 hr: condizioni di buio fino al momento dell&#39;esperimento. Nota: Questo deposito consente in linea di raggiungere la prova di apprendimento successivo effettuato nella stanza ambiente controllato, che aveva le condizioni ottimali per l&#39;apprendimento Drosophila e, soprattutto, elimina ogni queto quotidianovariazioni ambien- che potrebbero essere colpiti fenotipo comportamentale. </li></ol> 2 Preparazione prima dell&#39;esperimento <ol><li> Eseguire gli esperimenti in perspex T-labirinto su misura (Figura 1). </li><li> Controllare regolarmente il raccordo al fine di garantire una chiusura ermetica che si ottiene durante l&#39;esperimento tubo. Se necessario, cambiare gli O-ring che sigillano i compartimenti interni della T-labirinto. </li><li> Posizionare le griglie di rame su misura all&#39;interno dei tubi di formazione. Controllare e pulire le griglie regolarmente, e sostituire se ossidato. Fissare le griglie di rame a fili con clip a coccodrillo che corrono a uno switch-box collegato ad uno stimolatore elettrico. Utilizzare un voltmetro per assicurarsi che l&#39;apparecchio sta erogando la scossa necessaria. </li><li> Utilizzare g-morsetti per tenere il labirinto saldamente per evitare perdite di aria. </li><li> Collegare il T-labirinto di tubi che corre ad una pompa ad aria, per consentire gli odori da trarre attraverso le mosche e successivamente rimossi dal T-labirinto. Mantenere l&#39;aria miteportata a ~ 2 L / min </li></ol> 3. Odore diluizioni <ol><li> Utilizzare due odori differenti a concentrazioni tali che le mosche mostrano una preferenza uguale per entrambi gli odori. Utilizzare 4-METILCICLOESANOLO (1:67) e 3-ottanolo (1: 100) diluito in olio minerale 7,13. Nota: determinare accuratamente queste concentrazioni, che variano da laboratorio. Ad esempio, altri usano 01:10 per entrambi gli odori 24. Altri odori comunemente usati includono acetato di etile e acetato di iso-amile. </li><li> Pipettare 30 ml di odore diluito in una tazza odore misura collocato in un blocco odore coperto da un tubo di plastica con una parte superiore forata che permette all&#39;aria di essere disegnato sopra l&#39;odore nella tazza, esponendo così le mosche per un pennacchio odore. </li></ol> 4. Formazione Protocol (figure 1 e 2) <ol><li> Per l&#39;adulto olfattiva scossa condizionata, effettuare tutti gli esperimenti sotto una luce rossa fioca (es., LED rosso), che consente al ricercatore di vedere, ma impedisce la fly da vedere, permettendo così in linea di concentrarsi sul olfatto al contrario di input visivi. </li><li> Introdurre le mosche nel tubo di formazione e poi allegare alla T-labirinto e consentire loro di adattarsi al tubo e flusso d&#39;aria per 90 secondi. </li><li> Presentare il primo odore (4-METILCICLOESANOLO, MCH), con una scossa di 60 V (composto da dodici impulsi di 1,25 sec con intervalli tra impulsi 3.75 sec) per una durata complessiva di 60 sec. </li><li> Seguire lo shock con un periodo di riposo di 30 secondi, senza un odore o scosse. </li><li> Presentare il secondo odore (3-ottanolo, OCT) per 60 sec senza scosse. </li><li> Seguire lo shock con un periodo di riposo di 30 secondi, senza un odore o scosse. </li><li> Spostare linea dalla camera di addestramento nella camera centrale del T-labirinto ruotando il T-labirinto su un lato e delicatamente sbattere fondo del T-labirinto su una superficie morbida come un vecchio tappetino mouse. Mantenere le mosche nella camera centrale per 90 secondi. </li><li> Montare i tubi di scelta nel bottom dell&#39;apparato per formare il T-labirinto. </li><li> Per misurare l&#39;apprendimento, spostare le mosche al punto di scelta del T-labirinto, dove sono stati esposti contemporaneamente ad entrambi gli odori e muoversi verso uno. Eseguire un periodo di prova per 120 sec. </li><li> Trappola linea nei tubi scelta facendo scorrere la camera centrale fino in tal modo bloccando le estremità dei tubi di scelta. Raccogliere le mosche in ogni braccio della T-labirinto e nel vano centrale in fiale alimentari e conteggio. </li><li> Per misurare la memoria, raccogliere le mosche dopo l&#39;allenamento (4.6) e trasferirli dal T-labirinto per fiale alimentari senza lievito. Conservare vola al buio a 25 ° C e 70% di umidità per il tempo necessario rimanente per determinare la fase memoria di interesse (vedi introduzione). Reintrodurre le mosche al T-labirinto come in fase 4.7. </li><li> Per la memoria a lungo termine, utilizzare un labirinto costruito su misura che consente a numerosi lotti di mosche per essere formati contemporaneamente. Somministrare 5 cicli di formazione con un 15 min inter-ciclo intervallo (spaced) o senza un intervallo inter-ciclo (ammassate). Mantenere in linea a 18 ° C e 70% di umidità nel buio fino a prova. Prima della prova, spostare le mosche a 25 ° C e consentire loro di acclimatare per almeno 1 ora. Valutare memoria a lungo termine 24 ore dopo l&#39;allenamento. </li><li> Dopo gli esperimenti comportamentali, pulire le tazze odore con acqua calda e detersivo inodore. Dopo l&#39;essiccazione, cappotto le tazze con 10 microlitri Sigmacote. Essiccare il Sigmacote mediante riscaldamento in un forno a microonde. Di tanto in tanto pulire il T-labirinto in perspex tubi e blocchi odore con acqua calda e detersivo inodore. </li></ol> 5 Calcolo del Performance Index: una misura della Memoria delle mosche &quot; <ol><li> Calcolare il Performance Index (PI) per ogni condizione, come il numero di mosche evitando l&#39;odore shock accoppiati (CS -) meno il numero di mosche che scelgono l&#39;odore shock accoppiati (CS +) diviso per il numero totale di mosche (CS - + + CS) 1. PeIndice rformance (PI) = (# CS - vola - # CS + aria) / (# mosche totali) </li><li> Calcolare il PI finale dell&#39;esperimento la media della PI dell&#39;esperimento in cui MCH era l&#39;odore shock associato e quello in cui ottobre è stato l&#39;odore di shock-accoppiato. Ciò elimina ogni distorsione delle mosche che hanno una maggiore preferenza per un odore. </li></ol> 6. Controlli sensomotoria <ol><li> Eseguire odore acutezza introducendo ~ 40-50 mosche nel T-labirinto 6,7,17. </li><li> Dopo 90 sec, spostare le mosche al punto di scelta, e permettere loro 2 min di scegliere tra odori puri e aria. </li><li> Raccogliere e contare le mosche. Calcolare la percentuale di evasione dividendo il numero totale di mosche che hanno scelto l&#39;odore da parte di coloro che hanno partecipato alla prova. </li><li> Per urti reattività 6,7,17, introdurre le mosche nella camera di shock. </li><li> Dopo 90 secondi di riposo, somministrare una scossa elettrica di 60 V DC, da cui le mosche possono sfuggire a una similetubo senza shock. </li><li> Lasciare 2 min per le mosche di scegliere; raccogliere e contare le mosche. Calcolare la percentuale di shock evitare dividendo il numero di mosche che evitare lo shock da sfuggire al tubo d&#39;urto per il numero totale di mosche in dell&#39;esperimento. Includere le mosche che rimangono nella camera centrale del totale di coloro che sfuggiva la scossa elettrica. </li></ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La Drosophila adulto choc olfattivo apprendimento saggio qui presentato consente l&#39;analisi dei meccanismi molecolari alla base diverse fasi di memoria, tra cui memoria a lungo termine 15-17. Così come la determinazione degli effetti dei ritmi circadiani sonno 18, 19, 20,21, dieta senescenza 11-13, malattia neurodegenerativa 5 e trattamenti farmacologici 5,6,19 sulla memoria. Molti approcci potenti sono state recentemente sviluppate per l&#39;imaging funzionale dei circuiti neurali che mediano la memoria olfattiva di mosche 3,4,7,11,16,27. Queste tecniche optogenetic utilizzano il vasto repertorio dei diversi promotori disponibili in Drosophila 14,16. Questi promotori sono usati per esprimere geneticamente codificati calcio e cAMP giornalisti nei neuroni di memoria 16,27 per studiare l&#39;effetto di mutazioni geniche specifiche sulle tracce di memoria. The l&#39;uso di promotori condizionali e mutazioni negli adulti permette lo studio del ruolo post-sviluppo di un prodotto genico nella memoria 3,4,6,7,13,14. Imaging e approcci comportamentali possono essere combinati con canali leggeri e termo-attivo per stimolare o inibire diversi neuroni nel circuito di memoria 11,14,16,22-24 per chiarire ulteriormente la loro funzione. Inoltre, i neuroni della memoria del corpo fungo sono accessibili a cellule intere registrazioni di patch clamp 28, e le tecniche matematiche e computazionali vengono utilizzati per modellare Drosophila memoria olfattiva 29. Questi progressi sperimentali, combinati con le diverse forme di protocolli di memoria associativa introdotte qui, consentono di Drosophila da utilizzare per modellare le molecular- ea livello di circuito cambiamenti nella memoria associativa che si verificano in risposta alla ricompensa, punizione, la motivazione, la dipendenza, l&#39;invecchiamento e le malattie 5,6,11-13,16,30-31.

Il metodo qui presentato è quello descritto da Tully e Quinn con alcune piccole modifiche 1. L&#39;esperimento viene eseguito in due fasi: le mosche sono formati nella prima fase, e le mosche addestrati sono testati nella seconda fase. Durante l&#39;allenamento, un gruppo di mosche sono contemporaneamente esposti agli odori 1 (CS +) e una scossa elettrica (US) in un tubo di formazione. Le mosche quindi ricevono odore 2 (CS -), senza una scossa elettrica. Questo singolo accoppiamento di un odore particolare con una scossa si chiama formazione 1-ciclo, e gli odori che vengono utilizzati più di frequente sono 4 METILCICLOESANOLO (MCH) e 3-ottanolo (OCT). Formazione Un ciclo porta alla formazione di una fase labile di memoria che può essere rilevato fino a 7 ore; tuttavia, la memoria è in genere testato immediatamente per determinare ciò che viene definito apprendimento, acquisizione o 2 min di memoria. Memoria misurata a 30 min o 1 ora viene indicato come la memoria a breve termine, mentre3 hr memoria viene definita come memoria intermedia. L&#39;esposizione di mosche per cicli di formazione ripetitivi con spazi tra i cicli di formazione (formazione distanziati) conduce ad una forma consolidata di memoria a lungo termine, che è la trascrizione CREB dipendente e dura fino a una settimana. Formazione senza lacune (formazione concentrati) porta alla formazione di memoria anestesia-resistente (ARM), che simile alla memoria a lungo termine, viene tipicamente misurata 24 ore dopo 5 cicli di formazione 7,13,15-17,20,21. Con questo approccio, l&#39;effetto di varie mutazioni geniche su queste diverse fasi di memoria può essere determinato. L&#39;espressione promotore-driven di transgeni leggeri o sensibili alla temperatura per attivare o bloccare l&#39;attività neuronale dei neuroni specifici permette di indagare quali i neuroni sono necessari per l&#39;acquisizione della memoria, il consolidamento e il recupero 3,4,11,15,16,20, 22-24. Memoria a 1 ora è in genere misurata quando si studia compromissione della memoria legati all&#39;età, perché questo form di memoria appare particolarmente vulnerabili agli effetti dell&#39;invecchiamento 11-13. Una gamma completa di controlli comportamentali e genetici vengono eseguiti con esperimenti di memoria, per esempio, per determinare se un difetto prestazione è causa di un difetto di memoria centrale o un difetto sensoriale periferica che impedisce al volo da rilevamento shock o cue olfattiva 5 -7, 1 7, 25,26.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:28px;">Materials</td>
			<td style="width:139px;height:28px;">Source</td>
			<td style="width:116px;height:28px;">Cat. No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">3-Octanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">218405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">4-Methyl cyclohexanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">15,309-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Benzaldehyde</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">418099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Fluka</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Hexyl acetate</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">108154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Fructose</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:22px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;height:22px;">Bioline</td>
			<td style="width:116px;height:22px;">BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila adult olfactory shock learning

Drosophila sono stati utilizzati in esperimenti classici di condizionamento da oltre 40 anni, in tal modo facilitando notevolmente la nostra comprensione della memoria, compreso il chiarimento dei meccanismi molecolari coinvolti in malattie cognitive 1-7. Apprendimento e memoria possono essere dosati in larve per studiare l&#39;effetto dei geni dello sviluppo neurologico 8-10 e in mosche per misurare il contributo dei geni plasticità adulti 1-7. Inoltre, la breve durata della Drosophila facilita l&#39;analisi dei geni che mediano relativo all&#39;età di memoria impairment 5,11-13. La disponibilità di molti promotori inducibili che suddividono il sistema nervoso Drosophila permette di determinare quando e dove è richiesto un gene di interesse per la memoria normale così come relè di diversi aspetti del segnale di rinforzo 3,4,14,16. Memoria Studiare in adulti Drosophila permette una dettagliata analisi delcomportamento e circuiteria interessato e una misurazione di memoria a lungo termine 15 -17. La lunghezza della fase adulta ospita manipolazioni genetiche, comportamentali, dietetiche e farmacologiche a lungo termine della memoria, oltre a determinare l&#39;effetto di invecchiamento e malattie neurodegenerative sulla memoria 3-6,11-13,15-21. Condizionamento classico è indotta dalla presentazione simultanea di una stecca odore neutro (stimolo condizionato, CS +) ed uno stimolo di rinforzo, ad es., Scosse elettriche o saccarosio, (stimolo incondizionato, USA), che siano associati tra loro con l&#39;animale 1,16. Uno stimolo seconda condizionato (CS -) viene successivamente presentata senza gli Stati Uniti. Durante la fase di test, Drosophila sono contemporaneamente presentati con CS + e CS-odori. Dopo la Drosophila sono fornite tempo di scegliere tra gli odori, la distribuzione degli animali viene registrato. Questa procedura albassi associative condizionata repulsivo o appetitivo per essere attendibilmente valutato senza pregiudizi introdotto dalla preferenza innata per uno degli stimoli condizionati. Vari esperimenti di controllo vengono eseguiti anche per verificare se tutti i genotipi rispondono normalmente odori e rinforzo da solo.

L&#39;indice di prestazione (PI) serve come misura di memoria. La tabella 1 illustra un calcolo rappresentante di PI. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MCH accoppiato con scossa </td><td> 3 ottobre accoppiato con scossa </td></tr><tr><td> Mosche evitando MCH (in tubo di ottobre) = 80 Le mosche preferiscono MCH (in tubo di MCH) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6 </td><td> Mosche evitando ottobre (in tubo di MCH) = 75 Le mosche preferiscono ottobre (in tubo di ottobre) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0.5 </td></tr><tr><td> PI dell&#39;esperimento = (0,6 + 0,5) /2=0.55 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1 Un calcolo rappresentativo dell&#39;indice di prestazione utilizzando i dati illustrativi. Indici di prestazione per diversi esperimenti può essere paragonato a chiarire gli effetti di memoria. Una volta che taleconfronto è mostrato in Figura 3, che contiene i risultati di una serie di esperimenti effettuati con il Canton S mosche adulte di tipo selvatico (WT) e ignorante di apprendimento mutante adulto vola 1. La media di 10 PI è fornita, con barre di errore rappresentano l&#39;errore standard della media (SEM). Questi risultati dimostrano che le mosche somaro mostrano una riduzione di apprendimento rispetto al tipo selvatico. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1.jpg" /> Figura 1 L&#39;adulto set-up sperimentale. Le mosche sono addestrati e testati in un labirinto T. La formazione implica che presenta un odore A con scosse elettriche, seguito da un secondo odore B senza scosse elettriche. Dopo un periodo di riposo nella camera centrale linea sono rappresentati con entrambi gli odori contemporaneamente. Le mosche sono intrappolatinei due tubi e raccolti e contati per ottenere punteggi di apprendimento / memoria. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2.jpg" /> Figura 2 Il protocollo di formazione degli adulti. Le mosche si allena in due fasi. Il primo passo in cui le mosche ricevono un odore (CS +) in coppia con scosse elettriche (US) per 60 sec. Nella fase successiva mosche ricevono un secondo odore (CS), senza scosse elettriche. Le mosche sono quindi autorizzati a riposare per 90 secondi dopo di che sono stati testati per la loro scelta tra CS + e CS. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3 Un grafico rappresentativo che mostra somaro e l&#39;apprendimento di tipo selvatico in adulti Drosophila. </strong&gt; WT e mosche asino sono stati testati dopo una sessione di allenamento. Mosche somaro mostrano una riduzione di apprendimento rispetto al WT (n = 10).

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Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Il metodo per misurare adulti Drosophila memoria associativa è descritta. Il test si basa sulla capacità della mosca per associare un odore presentato con un rinforzo negativo (folgorazione) e poi richiamare queste informazioni in un secondo momento, permettendo di memoria da misurare.

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

27.8K Views.  University of Bristol.  Il metodo per misurare adulti Drosophila memoria associativa è descritta. Il test si basa sulla capacità della mosca per associare un odore presentato con un rinforzo negativo (folgorazione) e poi richiamare queste informazioni in un secondo momento, permettendo di memoria da misurare. 

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Ricerca

Neuroscienze

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; In un Olfattometro quattro quadranti

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Gusto Preferenza Assay per adulti<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Condizionamento del corteggiamento di Drosophila come misura dell&#39;apprendimento e della memoria

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.