These studies were funded by grants received from the NIH (MH082876, DA023988).

! ATTENZIONE: Questo protocollo prevede l&#39;utilizzo di laser di Classe 3B e richiederà orientamenti formazione e di sicurezza adeguate da seguire. Occhiali di sicurezza devono essere indossati in ogni momento durante il funzionamento laser, con procedure di allineamento presentano un rischio particolarmente elevato. Contattare il fornitore del laser per determinare l&#39;occhiale che fornirà attenuazione massima per un dato laser. Se disponibile, iscriversi ad un corso di sicurezza di formazione laser istituzionale. Non utilizzare mai un laser senza gli occhiali di sicurezza appropriate e di formazione. 1. Apparecchiatura Laser Set-up Se del caso, passi in sezione 1 sono designati come (A) o (B) per distinguere tra sistemi laser singolo o doppio, rispettivamente. <ol><li> Attaccare e fissare laser per la basetta. Breadboards sono ottimi conduttori di calore e agire come un dissipatore di calore per evitare danni ai componenti interni del laser con l&#39;uso prolungato. </li><li> (A) Fissare la las pre-accoppiatoer a un 10 &quot;x 12&quot; tagliere (o come richiesto) con ¼-20 &quot;viti e le rondelle (Figura 2A). Se i fori breadboard non si allineano con i fori di montaggio laser, usare piccoli &quot;pinze tavola&quot; per garantire laser a basetta. </li><li> (B) Se da utilizzare i 2 laser hanno molto diverse altezze dei raggi (&gt; ~ 1 cm), utilizzare piccoli 4 &quot;x 6&quot; basette di creare una piattaforma per uno dei laser. Collegare queste schede ai principali grandi 12 &quot;x 18&quot; tagliere con ¼-20 viti &quot;con le rondelle, quindi collegare il laser per le tavole più piccole con viti o morsetti da tavolo, come mostrato in Figura 2B. Attaccare l&#39;altro laser direttamente alla basetta con viti o un morsetto da tavolo ad altezza variabile. Fase critica: Breadboards, viti, e componenti ottici possono essere acquistati come imperiali o metriche in modo da essere coerente, acquistando; l&#39;impostazione predefinita per questo protocollo è imperiale. </li><li> (A)Attaccare una spessa giacca piatto fende / contatto fisico (FC / PC) cavo di collegamento al connettore (indicato come un cavo accoppiatore; vedi Figura 3) che è fisicamente attaccato alla parte anteriore del laser (Figura 2A). </li><li> (B) Infilare il raccordo su un ¾ &quot;post ottica, quindi epossidica il giunto tra l&#39;accoppiatore e la parte superiore del montante con JB Kwik, o resina epossidica simile, per prevenire allentamento e di allineamento durante l&#39;uso. Fissare il montante alla basetta (come i buchi breadboard non sempre allineati con la posizione richiesta di componenti ottici, un post holder, adattatore trespolo, e bloccaggio della forcella sono utilizzati per fissare posto ottico del accoppiatore a posto). Collegare un cavo patch spessa giacca (cavo accoppiatore) sul retro del connettore. </li><li> (B) Inserire il primo specchio di sterzo per il laser blu nel supporto cinematico, e fissarlo alla basetta con un ¾ &quot;post ottica. Attaccare questo post per un adap di baseter e forcella di bloccaggio. Posizionare la forcella di bloccaggio e post assemblaggio direttamente di fronte al laser blu con specchio inclinato a 45 ° per guidare il laser verso lo specchio dicroico. Utilizzare il modello di griglia di fori sulla basetta come guida allineamento approssimativo. Una volta posizionata all&#39;incirca, utilizzare una vite ¼ &quot;-20 tappo per fissare la forcella di fissaggio alla basetta (vedi figure 2B, C). </li><li> (B) Inserire lo specchio dicroico in un supporto cinematico e allegarlo a un &quot;post ottica 1 e fissare direttamente alla basetta. Posizionare lo specchio dicroico verso l&#39;estrema sinistra di, e in linea con lo specchio laser blu. Angle lo specchio dicroico ad un angolo di 45 ° in modo tale che la luce blu riflessa il primo specchio si riflette nella accoppiatore, quindi stringere la vite di fissaggio del supporto cinematico al palo (vedi figure 2B, C). </li><li> (B) Fissare il primo specchio di sterzo per il laser giallo ad una ¾ &quot;post ottica. Fissare il optical post per un adattatore di base e forcella di bloccaggio. Posizionare la forcella di bloccaggio e post-insieme direttamente davanti laser gialla e l&#39;angolo lo specchio con un angolo di 45 ° in modo che la luce gialla sarà diretto verso il secondo specchio di sterzo. Fissare la forcella di bloccaggio in posizione con un ¼ &quot;-20 vite e rondella. </li><li> (B) Fissare il secondo specchio di sterzo per il laser giallo per un &quot;post ottica 1. Angle lo specchio in modo tale che il fascio di luce gialla dal primo specchio sarà riflessa attraverso il dicroico e nel manicotto (Figura 2C). Fissare il posto direttamente al tagliere e stringere la vite di fissaggio, una volta lo specchio è inclinato in modo appropriato. Regolazioni fini specchio saranno effettuati utilizzando attacco specchio cinematici in un passaggio successivo. </li><li> (B) Applicare una ruota filtro a densità neutra per un ¾ &quot;post ottica e inserire il palo in un supporto posto attaccato ad una base di montaggio. Fissare l&#39;ensemble alla basetta tra la prima e sespecchi giallo cond utilizzando un unico ¼ &quot;-20 vite. Questa ruota viene utilizzato per regolare la potenza della luce laser giallo raggiungendo l&#39;accoppiatore. Suggerimento: stringere individualmente tutti i componenti (come ad esempio le viti che fissano titolari specchio cinematiche alla parte superiore dei posti, e i fili che tengono adattatori di base alla parte inferiore di posti) prima di essere esposti alla base. Utilizzare un albero di una piccola chiave esagonale in cui, attraverso fori di messaggi ottici per ottenere una coppia sufficiente. Questo consentirà di evitare componenti allentamento durante l&#39;utilizzo, necessitano di riallineamento. </li><li> Collegare un FC / PC a / PC adattatore L-staffa FC alla basetta. </li><li> Optional: Fissare un 1 x 2 50/50 mini fibra cubo splitter direttamente alla basetta per simultanea stimolazione in vivo di due o più animali. Inoltre, le maniglie possono essere aggiunti per facilitare il movimento del gruppo basetta (come si vede nella Figura 2A). </li></ol> 2. Laser Coupling (senza contatto Style Coupling) Questa sezione riguarda la dual-laser set-up (Figura 2B). Allineare il percorso interiore laser blu prima di allineare il percorso esterno laser giallo. ! ATTENZIONE: Utilizzare un accoppiamento basso potere di luce (~ 1 mW) per garantire la sicurezza degli occhi. Indossare occhiali protettivi per accendere il laser e fino a quando l&#39;intensità della luce viene misurata e considerato sicuro. <ol><li> Impostare gli interruttori sul retro del laser a &quot;Curr&quot; (corrente) e la modalità logica transistor-transistor (TTL) + per l&#39;illuminazione costante (in contrapposizione alla modalità analogica). Assicurarsi che la manopola di alimentazione sulla parte anteriore del conducente è fissato a zero. Accendere il laser accendendo il driver e poi il tasto laser. </li><li> Lentamente regolare la manopola di accensione situato sulla parte anteriore del driver laser in modo che la luce laser ~ 1 mW viene emesso. Attendere 10 - 15 minuti (o come specificato dal costruttore) per laser per riscaldarsi. </li><li> Collegare il cavo tester fibra ottica direttamente alla free fine del cavo di connessione accoppiatore e accendere il tester cavo (Figura 3A). Regolare l&#39;angolo del raccordo in modo che il raggio rosso viaggia direttamente verso il centro dello specchio dicroico. Il percorso ottico della luce rossa emessa dal tester cavo è il percorso esatto che la luce laser ricevuta dovrà seguire per essere accoppiato nel laser. </li><li> Eseguire un allineamento grossolano: Utilizzare le manopole laterali e orizzontali sugli specchi cinematiche per orientare il fascio di luce laser in attacco. I morsetti piedistallo può essere necessario allentare per riposizionare leggermente gli specchi e l&#39;accoppiatore. I supporti cinematiche dovrebbero ancora avere qualche viaggio a disposizione per ulteriori regolazioni fini. Non interessati se nessuna luce blu è emessa dal cavo di zona accoppiatore iscritti in questo momento. </li><li> Inserire un singolo foglio di carta semi-traslucida direttamente di fronte allo specchio dicroico, tra l&#39;accoppiatore dicroico e. Ci saranno sia un blu e ared puntino su questa carta dal laser e il tester per cavi, rispettivamente. Utilizzare carta è traslucido abbastanza per vedere sia i punti rossi e blu simultaneamente dallo stesso lato della carta. </li><li> Effettuare regolazioni fini al primo specchio di sterzo (cioè quello più vicino al laser, non il dicroico) regolando attentamente le manopole laterali e orizzontali per allineare il centro del punto rosso con il punto blu. </li><li> Spostare la carta verso il copulante in modo che sia direttamente di fronte l&#39;accoppiatore e regolare le manopole sul secondo (cioè dicroico) specchio per allineare il raggio laser con il fascio rosso. </li><li> Iterare su passi 2.6 e 2.7 fino al centro dei raggi blu / giallo e rosso sono esattamente allineati in entrambe le posizioni (cioè, fino a quando i raggi rossi e blu sono colineare). </li><li> Rimuovere il tester per cavi dal cavo connettore. La luce laser dovrebbe essere emesso dalla fine del cavo di connessione accoppiatore. </li><li> Determine efficienza di accoppiamento misurando la potenza luminosa emessa dalla punta della fibra del cavo di connessione accoppiatore utilizzando un misuratore di potenza. Utilizzare l&#39;impostazione di 500 mW sul fotodiodo del misuratore di potenza e modificare l&#39;impostazione di lunghezza d&#39;onda (λ) al blu (473 nm) o giallo chiaro (635 nm) dello spettro a seconda del laser utilizzato. </li><li> Posizionare la punta della fibra perpendicolare al fotodiodo per ottenere una lettura di potere. Confrontare la potenza luce che entra l&#39;accoppiatore per la potenza luminosa emessa dalla estremità della fibra. Una efficienza di accoppiamento del&gt; 80% è considerato molto buono. Molto piccole ulteriori regolazioni del secondo specchio sterzo a volte può migliorare un po &#39;l&#39;accoppiamento. In generale, quando il fascio di luce dalla fine della fibra di accoppiamento è un piccolo, stretto, punto centrale (senza anelli circondano), accoppiando efficienza nel nucleo della fibra è ottimale. </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,11 per l&#39;accoppiamento laser giallo, l&#39;eccezione di usare i due specchi di sterzo per il laser di colore giallo (Figura 2C). Do not regolare la posizione dello specchio dicroico o allineamento del laser blu sarà persa. </li></ol> 3. In vivo optogenetic stimolazione Assicurarsi che tutte le procedure che comportano l&#39;impiego di animali siano condotte in conformità con le linee guida locali e nazionali e approvate dal corrispondente Animal Care and Use Committee Istituzionale. <ol><li> Fibra ottica set-up (vedere Figura 3B per l&#39;identificazione dei diversi tipi di patch cord di cui sotto). Per stimolare un singolo mouse, collegare il cavo di zona di accoppiamento di un cavo di collegamento di spessore in giacca con il FC / FC adattatore L-staffa direttamente collegato alla basetta (vedi Figura 4A). Per stimolare due animali da un laser, collegare il cavo di connessione accoppiatore a due patch cord di spessore in giacca con il 1 x 2 50/50 mini cubo (vedi Figura 4B). Per stimolare tre o più animali, collegare il cavo di accoppiamento di uno splitter fibra multimodale con la 1 x 2 mcube ini già attaccato alla basetta (vedi Figura 4C). </li><li> Collegare un commutatore / giunto rotante alle estremità libere della patch cavo / fibra spessa camicia splitter. Commutatori sono essenziali in quanto consentono la rotazione della fibra con il movimento del roditore, che impedisce l&#39;accumulo di coppia sul cavo patch. Troppo coppia può torcere cavi, portare alla rottura, e interferire con il movimento naturale dell&#39;animale durante i test. </li><li> Collegare il cavo di collegamento degli animali al collettore. </li><li> Attaccare un manicotto diviso collega all&#39;estremità libera ghiera metallica del cavo di connessione animale (Figura 5). Non forzare il manicotto tutta la strada fino alla ghiera; lasciano ~ 0,5 cm manicotto esposti come questo è ciò che connette alla fibra ottica impiantato apposto all&#39;animale (Figura 6). Fase critica: acquistare sempre le maniche che contengono una scissione per consentire l&#39;espansione della manica su fibra puntale impiantato durante il collegamento erimozione. Troppo stretto di una misura può causare gravi traumi per l&#39;animale se l&#39;impianto sloggia dal cranio durante il tentativo di staccare il manicotto dall&#39;impianto. Se questo si verifica, l&#39;animale deve essere rimosso dallo studio e ricevere cure immediate veterinario. Analogamente, prima di usare un nuovo manicotto per la prima volta, &#39;romperlo in&#39; da collegare e scollegare una ghiera fino disconnette con la quantità desiderata di forza. Tip: È facile da rompere una fibra mentre rimuove un manicotto che è strettamente collegato ad una ghiera. Per evitare questo, spingere il puntale inserendo una piccola asta di legno nell&#39;estremità aperta del manicotto (il manico di un tampone di cotone standard è la dimensione giusta). </li><li> Collegare il driver laser blu ad un generatore di impulsi utilizzando un cavo BNC e ruotare il generatore di impulsi su. </li><li> Mettere occhiali di protezione su. Impostare gli interruttori sul retro della modalità &quot;Curr&quot; e &quot;TTL +&quot; laser. Assicurarsi that la manopola alimentazione sulla parte anteriore del conducente è impostato a zero andturn il laser (accendere il driver e poi il tasto laser). </li><li> Regolare la manopola di alimentazione sulla parte anteriore del laser in modo che di 5 - 10 mW viene emesso dalla punta della fibra patch cord animale come misurato utilizzando un misuratore di potenza luminosa. Di 5 - 10 mW è una guida generale - l&#39;intensità potenza esatta richiesta per incidere un dato volume di tessuto deve essere calcolato prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento, come in Aravanis et al 3. </li><li> Accendere il laser blu per la modalità &quot;analogica&quot; per la stimolazione in vivo. Nota: i laser DPSS gialle sono gestiti in TTL + modalità per l&#39;illuminazione costante. Attendere 10-15 minuti per il laser per riscaldare. </li><li> Frenare delicatamente il mouse e collegare il split-manica sulla patch cord animali alla fibra impiantabile cronica (vedere Figura 6). Assicurarsi che le estremità di due fibre fanno contatto fisico tra loro. Utilizzare la scissione sul bocchettone comefinestra per visualizzare il contatto diretto tra i due Fase critica:. Talvolta può raccogliere detriti sulla ghiera metallica di fibra impiantabile dell&#39;animale e interferire con il collegamento appropriato. In questo caso, utilizzare un etanolo pulire per pulire delicatamente la ghiera sulla testa dell&#39;animale prima allegato. Mai forzare un bocchettone oltre il puntale come questo può causare gravi traumi all&#39;animale. Se una connessione fisica tra estremità delle fibre non può essere effettuata dopo la pulizia, rimuovere l&#39;animale dallo studio. Suggerimento: la dispersione della luce può avvenire nel punto di collegamento tra il cavo di collegamento in fibra e animale impiantato. Visualizzazione di questa luce da roditori può presentare un confondere sperimentale 10. Termorestringente può essere collegato a patch cord e scivolò oltre il punto di collegamento per ridurre al minimo luce estranea. </li><li> Lasciare il mouse per recuperare per pochi minuti prima dell&#39;inizio della prova comportamentale. Suggerimento: Depending sul test comportamentali da somministrare, è meglio abituarsi topi al processo di connessione e tethering 2 - 3 giorni prima, come la gestione necessario per collegare l&#39;animale può indurre stress e confondere test comportamentali. </li><li> Posizionare il mouse nell&#39;apparato test comportamentali garantire che il cavo connettore è privo di strappi. Non lasciare mai un animale incustodito durante la stimolazione. Anche con l&#39;impiego di commutatori, cavi patch hanno una tendenza a ruotare durante lunghi periodi di tempo e possono interferire con il test comportamentale. </li><li> Utilizzare un generatore di impulso ad impulso laser blu ad una frequenza predeterminata che attiverà opsin di scelta. Per l&#39;uso del laser di colore giallo: impulsi laser di colore giallo con persiane esterne o semplicemente bloccando il percorso del fascio con una, non riflettente, oggetto non infiammabile opaco. </li></ol> 4. post in vivo Considerazioni stimolazione Questa sezione non è inteso per essere un proto completacol ma è offerto come guida per le procedure supplementari che dovrebbero essere considerati seguente vivo stimolazione optogenetic in. <ol><li> Al termine di un esperimento, confermare istologicamente virale e fibra di posizionamento per l&#39;interpretazione accurata dei risultati comportamentali. Euthanize animale secondo le linee guida istituzionali e profumato l&#39;animale con soluzione salina ghiacciata tampone fosfato (PBS) e 4% (w / v) di paraformaldeide in PBS. </li><li> Rimuovere impiantato fibra ottica impugnando saldamente la ghiera metallica esposta con pinze o emostatiche. Tirare in un liscio, ma rapido, movimento. E &#39;importante per testare l&#39;integrità della fibra impiantato misurando l&#39;emissione luminosa alla fine di ciascun esperimento. </li><li> Post-fissare il cervello in paraformaldeide per almeno 24 - 48 ore prima di sezionare attraverso la regione di interesse. (Se si utilizza un microtomo di congelamento, incubare cervelli in una soluzione di saccarosio del 30% per diversi giorni prima di sezionamento). Eseguire immunoistochimica utilizzando standaprotocolli RD per il rilevamento delle opportune fluorofori opsin-tagged, vale a dire, la proteina verde fluorescente (GFP), maggiore fluorescente giallo proteina (EYFP) o mCherry. </li><li> Visitare il sito di espressione opsina e fibra protesi al microscopio e confermare visivamente adeguato posizionamento di iniezione di virus e di impianto sulla base di coordinate scelto. </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest to report.

Gli attuali laser descritto set-up e le strategie tethering sono compatibili con una vasta gamma di test comportamentali roditori. Infatti, una serie di test comportamentali sono stati utilizzati in seguito, o di accompagnamento, la stimolazione optogenetic in vivo che includono le attività emotive, comportamentali condizionamento comportamentale, apprendimento e paradigmi di memoria, il sonno, l&#39;eccitazione e attività appetitive per citarne alcuni (vedi Nieh et al. 6 per una revisione completa). Optogenetics ha cambiato il modo in cui i test comportamentali tradizionali sono condotti dal fatto che gli studi più giorni può essere condensato in una sola seduta in cui il comportamento è confrontato, entro soggetti, durante epoche distinte di luce &#39;su&#39; contro &#39;off&#39; 5. Scomparti Da segnalare, apparati comportamentali che contengono porte, chiuse o altri ostacoli potrebbero dover essere modificati per accogliere il passaggio delle fibre tethered. Il descritto strategie tethering permesso siStimolazione multaneous di topi multipli da un singolo laser. Alta produttività test comportamentali optogenetic può quindi essere raggiunto attraverso l&#39;uso di più laser e apparecchiature di collaudo. Il numero di animali che possono essere stimolati simultaneamente, tuttavia, sarà limitata dalla massima potenza luminosa che può essere ottenuta ad ogni punta della fibra. Potenza massima sulla punta della fibra dipende dalla 1) potenza iniziale del laser; 2) efficienza di accoppiamento e 3) il numero di divisioni fascio. Per un laser blu 100 mW con ~ 80% efficienza di accoppiamento e fino a 4 divide fascio (come illustrato nella Figura 4C), potenza media sulla punta della fibra può variare tra 5-10 mW utilizzando 200 micron nucleo, 0,22 NA patch cord fibra (nb aspettarsi perdita di trasmissione da giunti rotanti essere &lt;15%). Misurazione emissione di luce sulla punta della fibra è essenziale per la determinazione adeguata potenza luminosa per l&#39;attivazione opsin come opsine differiscono nella loro sensibilità alla luce e quindi la densità di potenza luminosa (mW/ Mm 2) per l&#39;attivazione 11. Per esempio, il opsin passo-funzione stabile (SSFO) funge da accumulatore di fotoni e quindi richiede pochissima densità di potenza di luce per l&#39;attivazione (&lt;8 W / mm 2) 8. Confronta questo per la rodopsina canale tradizionale (ChR2), che richiede un minimo di 1 mW / mm 2 di luce per suscitare potenziali d&#39;azione 2. Tabella 1 viene fornito come riferimento rapido per noti irradianze leggeri minimi necessari per attivare le opsine più comuni attualmente in utilizzare. Infine, si deve considerare che diffonde la luce e assorbe mentre viaggia attraverso il tessuto cerebrale in modo tale che è necessaria più potenza di luce per strutture cerebrali profonde 3. Una risorsa online utile è disponibile in <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> che calcola l&#39;intensità della luce a diverse profondità attraverso il tessuto cerebrale tenendoconto delle dimensioni nucleo della fibra, apertura numerica, lunghezza d&#39;onda della luce impiegata, e la potenza luminosa a partire dalla punta della fibra. Per un&#39;eccellente panoramica dei principi teorici alla base di questi calcoli, consultare Foutz et al. (2012) 12. Esempi di come applicare questi principi e calcoli al disegno sperimentale sono dimostrate in Aravanis et al. (2007) 3 e Tye et al. (2012) 13. L&#39;esecuzione di queste calcoli prima dell&#39;inizio di un esperimento è fondamentale per garantire un&#39;adeguata irradianza luce per l&#39;attivazione opsin. Alla luce di queste considerazioni, è vantaggioso acquistare laser superiore alimentati per garantire un&#39;adeguata potenza. Laser con potenza compresa fra 100-200 mW sono generalmente sufficienti a compensare le fibre centrali piccole, fibre divisione multipla, inefficienza accoppiamento e la trasmissione perde 7. Se si utilizza il laser ad alta potenza, però, bisogna fare attenzione per evitare danni neurali o calore e luce-sociod artefatti che possono verificarsi con prolungata e / o ad alta potenza di illuminazione luce 7. Un range di sicurezza per esperimenti in vivo è fino a 75 mW / mm 2. 14 Scelta del tipo di laser per acquisto può essere una questione complessa in quanto vi sono molti fattori da considerare. Per esempio, i laser a diodo diretto forniscono uscita impulsiva più stabile e ripetibile di fare a stato solido (DPSS) laser a diodo pompato, e sono più affidabili nel tempo in un ambiente di laboratorio. In alcuni casi, tuttavia, laser a diodi diretti possono emettono una luce potenza inferiore, ~ 0,1 mW, anche quando la tensione di comando è 0 V a causa di una corrente di essere inviato al diodo dall&#39;elettronica di controllo del laser costante di bias. Questa emissione &#39;spontanea&#39; ha uno spettro più ampio di quanto non emissione laser dallo stesso laser, così può essere specificamente ridotto installando un passa-banda stretta (o &#39;pulizia&#39;) filtro tra il laser e accoppiatore (vedi lista pezzi). Questo filtro sarà ancheridurre la potenza da ~ 50% quando lasing, quindi l&#39;acquisto di un laser di potenza più elevata di conseguenza. Va notato che il laser DPSS gialli sono estremamente sensibili e possono comportarsi in modo irregolare e hanno ridotto durata se rapidamente modulato da un generatore di impulsi. Regolazione della potenza del laser giallo deve essere fatto attraverso ruote portafiltri densità esterni immessi nel percorso ottico (Sezione 1.7) durante l&#39;uso del laser in TTL + modalità. In alternativa, l&#39;acquisto di un verde 532 nm DPSS laser è una conveniente alternativa che può attivare sia halorhodopsins e archaerhodopsins. L&#39;apertura numerica (NA) di una fibra è importante considerare quando si progettano e l&#39;acquisto di componenti in fibra per gruppo laser set-up. La NA di una fibra ottica determina gli angoli di raggi di luce che possono essere accettate ed emessi alla punta di una fibra. Se una fibra superiore NA è accoppiato ad una fibra inferiore NA, significativa perdita si verifica a tale interfaccia, quindi è importante essere coerenti wi<html> th fibra NA all&#39;interno di una singola installazione (o per assicurarsi che NA aumenta lungo il percorso della luce). L&#39;effetto di fibra NA sul volume del tessuto cerebrale illuminata è meno importante, poiché il tessuto cerebrale è fortemente diffondenti, e poiché la luce accoppiata da una sorgente laser tenderà a fibre &quot;Underfill &#39;alto-NA; fibre ottiche ma con un NA di 0,22 e 0,37 sono comunemente usati. Allo stesso modo, l&#39;accoppiamento di un grande-core ad una fibra più piccola-core anche comportare perdite significative, in modo da essere sempre sicuri di utilizzare sempre più o uguale diametro di base durante la progressione dalla sorgente laser per l&#39;impianto degli animali. In linea generale, le estremità della fibra devono essere sempre tappate quando non in uso per evitare che polvere e particelle accumulo. E &#39;una buona idea per regolare estremità delle fibre pulite e connettori (70% di alcool isopropilico funziona bene) per garantire la massima potenza di luce, e per testare la potenza della luce attraverso un&#39; impianto di manichino &#39;prima di iniziare gli esperimenti di ogni giorno. &quot;&gt; Durante il test comportamentali, è imperativo che vengano presi provvedimenti per controllare gli effetti delle infezioni virali, l&#39;espressione della proteina esogena, luce visibile, e possibili effetti del riscaldamento dei tessuti e manufatti sul comportamento degli animali. Pertanto, il gruppo di controllo adeguato dovrebbe essere composto di animali trasdotte con un virus di controllo (ad esempio, GFP, EYFP, mCherry), che ricevono parametri di stimolazione luce identici. Verifica sperimentale è un ultimo passo cruciale in quanto i dati utilizzati per l&#39;analisi del comportamento è del tutto dipende da un appropriato opsina e il posizionamento della fibra ottica nella regione di interesse . In particolare, negli animali cui si rileva alcun segnale immunoistochimica, o quando collocamento di segnale o fibra non è nella regione di interesse, allora i dati comportamentali per tale animale devono essere rimossi dall&#39;esperimento. Inoltre, è essenziale testare uscita luce la punta della fibra sia prima impianto chirurgico e di nuovo post mortem al fine di garantire un adeguato potere della luce per l&#39;attivazione opsin. In animals cui si è verificato perdita di luce forte attraverso la fibra dopo la sperimentazione (&gt; 30%) 9, i dati per l&#39;animale dovrebbe essere considerato per la rimozione. Criteri per la rimozione dovrebbero essere stabilite a priori. Infine, si deve considerare la frequenza degli impulsi richiesta di modulare cottura neurale, che dipende dalla struttura del cervello e neuronali sottotipi nel mirino. Esistono parametri di stimolazione della luce optogenetic Pubblicato per più sottotipi neuronali, tuttavia, la capacità di modulare la cottura neurale dovrebbe essere confermato in modo indipendente attraverso in vivo o fetta cervello registrazioni elettrofisiologiche. Come si diventa abili con l&#39;utilizzo del laser e la modifica di laser set-up, combinazioni di diverse lunghezze d&#39;onda possono essere legati a più fibre in un singolo animale o consegnate lungo la stessa fibra per optogenetics combinatoria 8. Stimolazione multi-lunghezza d&#39;onda diventerà sempre più importante dato il rapido sviluppo di red-shifted channelrhodopsins 8, la progettazione di blu-spostato iperpolarizzanti opsine 15, l&#39;uso di bistabili opsine step-funzione 8,16,17, e l&#39;elenco generale espansione di opsine con l&#39;attivazione distinti spettri 11. Questa espansione del toolbox optogenetic permetterà il controllo senza precedenti di più sottotipi neurali all&#39;interno e tra le varie regioni del cervello per determinare il loro ruolo nel governo stati comportamentali complessi.

Optogenetics ha rivoluzionato i sistemi a livello di neuroscienze nella sua ricerca degli elementi del circuito neurale di guida stati comportamentali normali e malattie rilevanti. La scoperta che opsine microbiche sensibili alla luce 1 possono essere espressi in modo funzionale in cellule di mammifero ha fornito la piattaforma per l&#39;utilizzo di luce per ottenere un controllo senza precedenti di attività neurale con elevata precisione spaziale e temporale 2. A differenza degli approcci tradizionali elettrofisiologiche o farmacologici alla manipolazione dell&#39;attività neurale, optogenetics permette il controllo di specifici tipi cellulari (basata sulla proiezione genetica identificare o spaziale) all&#39;interno delle popolazioni eterogenee e in tempi fisiologicamente rilevanti. La successiva introduzione di un&#39;interfaccia neurale ottica disponibile uno strumento pratico per la consegna di luce a comportarsi animali 3. Questo ha permesso per la modulazione in tempo reale dei circuiti neurali definiti nei roditori Comportarsi sveglio al fine di testare la causalmenteruolo di questi circuiti neurali nel governo degli stati comportamentali rilevanti per le malattie neurologiche e psichiatriche 4-6. Optogenetics, quindi, rappresenta un potente strumento per l&#39;introduzione in tutti i laboratori interessati a indagare il rapporto funzionale tra attività cerebrale e misure comportamentali o fisiologici in modelli animali. Design di successo e il completamento di un esperimento optogenetic coinvolge varie fasi e le considerazioni (vedi Figura 1). L&#39;obiettivo del protocollo è di fornire gli individui con gli strumenti e componenti, insieme con la conoscenza teorica e pratica, necessario per eseguire la stimolazione optogenetic nei roditori Comportarsi sveglio. Attualmente, vi sono due lunghezze d&#39;onda predominanti utilizzati per attivare canali opsin microbici: nello spettro blu (comunemente 473 nm) e spettri verde-giallo (comunemente 532 o 591 nm). Entrambi laser e diodi emettitori di luce (LED) possono essere usati come sorgenti luminose a deliver specifiche lunghezze d&#39;onda della luce al tessuto cerebrale. La luce non coerente emessa dai LED, tuttavia, rende la trasmissione efficace della difficile luce quando l&#39;accoppiamento nelle piccole fibre di base necessari per la stimolazione in vivo roditori. Definizione del gruppo laser appropriato è un passo iniziale cruciale e dipenderà dalla destinazione d&#39;uso optogenetics in laboratorio. Il protocollo attuale descrive due configurazioni di base che si differenziano per la loro facilità di montaggio e l&#39;uso: singolo laser pre-accoppiati e sistemi dual laser (vedi figura 2). Sistemi a singolo laser che sono pre-accoppiati dal produttore sono essenzialmente ready-to-go all&#39;arrivo con poco o nessun set-up richiesto, ma hanno lo svantaggio di minima personalizzazione per l&#39;utente finale. Un sistema laser duale consente consegna di due diverse lunghezze d&#39;onda lungo la stessa fibra. Questo diventerà sempre più importante con l&#39;avvento di optogenetics combinatoria cui diverse lunghezze d&#39;onda possono essere utilizzati per attivare / inibire distinzionetipi di cellule T che sono spazialmente co-localizzato. Questo è essenziale anche per l&#39;uso con bi-stabili opsine funzione step in cui sono iniziati e terminati da luce blu e giallo, rispettivamente, 7,8 fotocorrenti. Sistemi laser doppio sono anche personalizzabili come l&#39;utente può aggiungere o rimuovere i componenti (ad esempio, persiane esterne, filtri fascio, contatori di potenza in linea) dal percorso del fascio, come richiesto. Grazie alla sua versatilità, il doppio laser set-up è consigliato se optogenetics sta per essere uno strumento costante utilizzato in laboratorio. Accoppiamento dei laser, tuttavia, può presentare una sfida e così un meccanismo di accoppiamento rapido, facile e affidabile è fornito in questo protocollo. Nota, i dettagli questo protocollo l&#39;assemblaggio di componenti ottici e utilizza cavi di connessione e componenti ottimizzati per le fibre step-index multimodali con un nucleo di 200 micron e una apertura numerica (NA) di 0,22. Diverse dimensioni core e NA sono disponibili per l&#39;acquisto, ma tutti i componenti devono corrispondere idealmente in termini di nucleodimensioni e NA per evitare la perdita di luce in punti di connessione in fibra. In alternativa, in un collegamento in fibra, la luce può passare da una piccola a una dimensione più grande nucleo; e / o da un basso NA ad un superiore NA fibra senza perdita aggiuntiva. Strategie tethering sono previste che consente la stimolazione simultanea di più topi per i test comportamentali high-throughput. I protocolli previsti presuppongono l&#39;uso di fibre impiantabili croniche per i test comportamentali, ma possono essere modificati per i protocolli di stimolazione acuta. Fibre Acutely impiantati sono vantaggiose per la combinazione con la stimolazione optogenetic manipolazione farmacologica, poiché la stessa cannula può essere usato per trasportare farmaci e la punta di una fibra ottica nella stessa posizione. L&#39;uso di fibre cronicamente impiantati è, tuttavia, altamente raccomandato per la prova comportamentale più giorni poiché riduce danno tissutale associato con l&#39;inserimento e la rimozione ripetuta di fibre e aumenta la precisione in termini di posizionamento coerente di fibre perilluminazione del tessuto 3. In combinazione con le configurazioni tethering qui descritte, il comportamento può essere registrato in modo affidabile su più giorni. Mesi, infatti, la trasmissione della luce affidabile e &#39;stato segnalato dopo l&#39;impianto in fibra di 9 in modo tale che la stimolazione cronica e paradigmi comportamentali test possono, teoricamente, essere eseguite su più giorni e settimane. Note aggiuntive sui componenti hardware sono stati aggiunti al protocollo per consentire la scelta del lettore nel miglior prodotto che soddisfa le loro esigenze individuali, comprese le alternative e prodotti convenienti che possono essere fatte in casa. Sono forniti anche consigli importanti che sono utili durante l&#39;installazione e l&#39;implementazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">1. Laser Set-up</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">100mW 473nm or 488nm Diode Laser System , &#60;2% Stability</td>
			<td style="width:59px;">Omicron</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">Luxx/Phoxx 473/488-100</td>
			<td style="width:245px;">Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">100mW 594nm DPSS laser</td>
			<td style="width:59px;">Colbolt</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0594-04-01-0100-300</td>
			<td style="width:245px;">04-01 series yellow laser; sensitive to back-reflection from fibers</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">200mW 532nm DPSS laser; 5% power stability</td>
			<td style="width:59px;">Shanghai Lasers</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">GL532T3-200</td>
			<td style="width:245px;">Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Non-contact style laser to multimode fiber coupler&#160;</td>
			<td style="width:59px;">OZ Optics</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td>
			<td style="width:245px;">For use with dual laser set-up; Specs: 33mm OD for 400-700nm; FC receptacle, f=20mm lens with post mount laser head adapter #11</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 12&#34; x 18&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1213</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 10&#34; x 12&#34; x 1/2&#34;. 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">MB1012</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Aluminum breadboard, 4&#34; x 6&#34; x 1/2&#34;, 1/4&#34;-20 Threaded</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">MB4</td>
			<td style="width:245px;">For blue laser; dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact variable height clamp, 1/4&#34;-20 Tapped</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">CL3</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">3/4&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TR075</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; stainless post</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">TR1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">PH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Pedestal Base Adapter</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BE1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Small Clamping Fork</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">CF125</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics with visible laser quality mirror</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">KM100-E02</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Neutral filter density wheel</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">NDC-50C-2M</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1&#34; Longpass dichroic mirror 50%</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DMLP505</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Kinematic mount for 1&#34; optics&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">KM100</td>
			<td style="width:245px;">For dichroic mirror</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">20-piece hex wrench kit with stand</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">TC2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">1/4&#34;-20 cap screw and hardware kit</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">HW-KIT2</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Mounting base 1&#34; x 2.3&#34;x3/8&#34;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">BA1S</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">ADAFCB1</td>
			<td style="width:245px;">Dual FC/PC L-bracket also available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Breadboard lifting handles</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">3</td>
			<td style="width:127px;">BBH1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">&#216;1&#34; Bandpass Filter, CWL = 450 &#177; 2 nm, FWHM = 10 &#177; 2 nm</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FB450-10</td>
			<td style="width:245px;">For use with diode lasers that spontaneously emit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">2. Laser Coupling</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">! Laser protective eyewear</td>
			<td style="width:59px;">Various</td>
			<td style="width:65px;">One for every user at each wavelength</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;">! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Fiber optic cable tester</td>
			<td style="width:59px;">Eclipse</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">902-186N</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">One-step fiber connector cleaner</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">FBC1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.75 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.75m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">For dual laser system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Coupler patch cord (0.5 meter)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">0.5m 200um core, 0.22NA, FC/PC connectors, multimode&#160;</td>
			<td style="width:245px;">For single laser system</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Doric mini cube</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">DMC_1x2_FC-2FC</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Compact power and energy meter console</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">PM100D</td>
			<td style="width:245px;">Digital 4&#34; LCD</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">C-series slim power sensor 5-500mW</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">S130C&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Multiple detectors types are available; check with vendor</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;"></td>
			<td style="width:59px;"></td>
			<td style="width:65px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="5" height="20" style="height:20px;width:800px;">3. In vivo Optogenetic Stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:59px;">Company</td>
			<td style="width:65px;">Quantity</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:245px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:304px;">Multimode fiber splitters</td>
			<td style="width:59px;">FONT Canada</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">Large core fiber optic 1 X 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Arbitrary waveform function generator (2 channel)</td>
			<td style="width:59px;">Rigol</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">DG1022</td>
			<td style="width:245px;">Can control up to 2 lasers at once</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:304px;">Fiber optic rotary joint (commutator)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC*</td>
			<td style="width:65px;">6 to 8</td>
			<td style="width:127px;">FRJ_1X1_FC-FC</td>
			<td style="width:245px;">*Also available through Thorlabs and Prizmatix</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:304px;">Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector)</td>
			<td style="width:59px;">DORIC</td>
			<td style="width:65px;">8</td>
			<td style="width:127px;">MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg)</td>
			<td style="width:59px;">Precision fiber Products</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">SM-CS1140S</td>
			<td style="width:245px;">Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Clear dust caps for &#216;2.5 mm ferrules (25/pkg)&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">1</td>
			<td style="width:127px;">CAPF</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:304px;">Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves&#160;</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">2</td>
			<td style="width:127px;">CAPF1</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:304px;">Thick-jacketed patch cords (custom order)</td>
			<td style="width:59px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:65px;">4</td>
			<td style="width:127px;">200um core, 0.22NA, FC/PC connectors multimode fibers</td>
			<td style="width:245px;">Length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Risultati comportamentali ottenuti con in vivo stimolazione optogenetic dipendono interamente sul circuito neurale essere presi di mira, il modello animale utilizzato, ed i parametri di modulazione. Per correnti scopo dimostrativo, neuroni dopaminergici nell&#39;area ventrale tegmentale, o VTA, di tirosina idrossilasi :: topi Cre state trasdotte con un passo-funzione stabile opsin (SSFO) 8, o Virus Control (EYFP), e un impianto di fibra era cronicamente impiantato. L&#39;uso di TH :: Cre topi transgenici assicura che opsin espressione è limitata a + cellule TH (dopamina) nel VTA. Figura 7 illustra risultati rappresentativi comportamentali ottenuti con l&#39;attuale set-up laser descritto per la stimolazione simultanea di più topi. Qui, i topi sono stati legati e stimolate contemporaneamente mediante laser separati (3 topi / laser come nella Figura 4C) e il comportamento locomotorio stato registrato per 1 ora. Stimolazione ripetuta di neuroni dopaminergici nel VTA ha determinato unfenotipo iperattivo che persiste per tutta la durata della stimolazione. Nessun cambiamento nel comportamento motorio è stato visto in EYFP topi (vedi Video 1). A seguito di test comportamentali, immunoistochimica è stata effettuata per verificare il targeting preciso virale per VTA neuroni dopaminergici e il posizionamento della fibra è stata confermata visivamente (vedi Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> Figura 1. fasi sperimentali per la stimolazione optogenetic in vivo. Ci sono quattro passaggi generali coinvolti durante la progettazione e l&#39;esecuzione di stimolazione optogenetic vivo. Questo protocollo dettagli in particolare i passaggi necessari per la fornitura di luce da una sorgente di luce laser di strutture cerebrali profonde nel roditore comportarsi e comprende 1) Gruppo sistema laser e l&#39;accoppiamento della luce; 2) strategie tethering per collegamen to più animali ad una fonte di luce per i test comportamentali high-throughput e 3) fornisce linee guida per confermare la strategia di targeting per la consegna di luce - un passo che è fondamentale per l&#39;interpretazione dei dati. Nota: anche se questo protocollo non è esclusiva di fibre impiantabili croniche a fini tethering, si raccomanda e presume quando si associa la stimolazione optogenetic con test comportamentali. Vedere entrambi Ung &amp; Arenkiel 2012 18 e Sparta et al., 2012 9 per in-house di produzione e l&#39;impianto di fibre ottiche croniche. Le linee continue = gradini rivestiti in questo protocollo. <img alt="Figura 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> Figura 2. Sistemi laser utilizzati per la stimolazione optogenetic in vivo. (A) sistema laser unico per la stimolazione in vivo. Questo laser è ph<html> ysically pre-accoppiati dal costruttore e richiede poco all&#39;utente finale di set-up. sistema laser Dual (B). Due laser sono accoppiati in una singola fibra attraverso l&#39;uso di specchi che agiscono per dirigere ciascun percorso ottico in un non-contatto style accoppiatore. Questo è il più versatile set-up come componenti ottici possono essere rimossi o aggiunti, se necessario, ma presenta più di una sfida in termini di accoppiamento laser efficiente. (C) Schema del doppio sistema laser mostrato in (B) indica il posizionamento del laser e specchi con il corrispondente percorso del fascio di luce laser (frecce) raffigurato. Qui, lo specchio dicroico &quot;D&quot; viene utilizzato per deviare lunghezze d&#39;onda di luce blu durante la trasmissione lunghezze d&#39;onda giallo fino alla accoppiatore &quot;C&quot; e nel cavo di collegamento accoppiatore allegata. B = laser blu; C = senza contatto stile accoppiatore; D = specchio dicroico; FW ruota = filtro; M = specchio; Y = laser giallo.ottenere = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Figura 3. tester (A) del cavo utilizzato nel protocollo di accoppiamento non fisico inferiore:. Tester cavo direttamente collegato a un cavo di collegamento. Inserisci raffigura punto di connessione di tester per cavi cavi (B) Patch di cui tutta protocollo da esterno a interno:.. Multimode fibra splitter, patch cord animale nero giacca con maniche bianco zirconia diviso attaccato al piatto Cleave (FC) end, patch cord spessa giacca (noto anche come &quot;cavo accoppiatore&quot;). Patch cord spessa giacca sono rivestiti con cloruro di polivinile (PVC) tubi per una maggiore protezione. Per questi cavi, industria codici colore standard vengono utilizzati per distinguere tra i diversi tipi di fibre, dove arancione = fibra multimodale. Patch cord animali sono<html> più sottile rivestito per consentire la flessibilità per il movimento degli animali durante i test comportamentali. Si noti che la polvere tappi sono posti su FC / PC termina quando i cavi non sono in uso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> Figura 4. strategie Tethering per in vivo stimolazione optogenetic di (A) un solo animale, (B) due animali; . (C) tre o quattro animali configurazioni possibili non si limitano a quelli sopra indicato - configurazioni multiple sono possibili grazie alla combinazione unica di adattatori, splitter in fibra, e cavi di connessione ramificate che sono disponibili in commercio o per ordine personalizzato. Nota: patch cord e splitter in fibra contengono connettori / PC FC su entrambe le estremità (solo un lato è raffigurato).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Figura 5. Connessione corrette e non corrette (rosso x) di un cavo di collegamento di una fibra ottica impiantabile con una split-manica. (Pannello sinistro) Una zirconia split-manicotto viene utilizzato per collegare un cavo di collegamento alla ghiera di una fibra ottica impiantabile (qui non apposto un animale). Freccia punta al punto di connessione tra il cavo di collegamento e impiantabile in fibra ottica. Confronta (pannello di destra), dove esiste un divario tra il cavo di collegamento e impiantabile in fibra ottica, come visualizzato attraverso la scissione del bocchettone. Notare la perdita di luce che può verificarsi con un collegamento improprio (in basso a destra). Inserto inferiore su upper pannello di sinistra raffigura singoli componenti utilizzati. Dall&#39;alto in basso dell&#39;inserto: dorico impiantabile cannula in fibra ottica, bianco zirconia split-manica, una TV a cleeve (FC) fine di una patch cord animale bianco in giacca (cavo pieno di patch mostrato nella Figura 3B). In tutti i pannelli, si noti che il manicotto di collegamento non è a filo con l&#39;estremità FC del cavo di connessione. Lasciare ~ 0,5 centimetri di un over-appendere per il collegamento alla fibra ottica impiantabile apposta per l&#39;animale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Figura 6. Side (a sinistra) e frontale (a destra) vista di un mouse con una fibra ottica impiantato collegato ad un cavo di collegamento. Utilizzare la spaccatura sul manicotto di collegamento per aiutare a visualizzare il corretto collegamento del cavo di zona to la ghiera della fibra ottica impiantato. Il punto di connessione è evidenziata da una casella tratteggiata rossa e anche raffigurato nel inserto superiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> Figura 7. Risultati rappresentativi. (Sinistra) lettura comportamentale di stimolazione optogenetic in vivo. Esempio di comportamento che si può ottenere con il laser descritto set-up e il protocollo tethering. Attività locomotoria è stato registrato durante la stimolazione optogenetic dell&#39;area ventrale tegmentale (VTA) in tirosina idrossilasi (TH) :: topi Cre (n = 7 - 8 / gruppo) trasdotte sia con un passo-funzione opsin (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) o il virus di controllo (AAV5-DIO-EYFP) nella VTA. Gruppi di tre topi sono stati contemporaneamente collegati a un singololaser come illustrato in Figura 4C e stimolati con un impulso 5 sec di 447 o 473 nm luce consegnato volta ogni 15 min. Due vie misure ripetute ANOVA ha rivelato una interazione di gruppo significativo x tempo (F = 3,39 15.27, p &lt;0,0001) e un significativo effetto principale del tempo (F 3,39 = 4.67, p = 0.007), per cui la stimolazione optogenetic aumentata attività locomotoria solo nei topi SSFO (Bonferroni post-hoc p &lt;0,0001, rispetto a t = 0 - 15 ora bin) determinando un aumento complessivo in attività locomotoria rispetto ai topi EYFP (effetto principale del gruppo: F 1,39 = 10.69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc p &lt;0,01 per t = i 15 - 30 e p &lt;0,001 per t = 30 - 45 e t = 45 - 60). Fibra specifiche: 200 micron di base, 0,22 NA. Luce irraggiamento = 6-66 mW / mm 2, corrispondente alla fibra distanza punta di 0,1-0,6 mm dal sito di iniezione virale con il potere della luce 5 mW emessa a punta della fibra prima di tethering. Barre di errore rappresentano errore standard della media. EYFPvs. SSFO: ** p &lt;0.01; *** P &lt;0,001; Effetto tempo: #### p &lt;0,0001 (destra) la conferma istologica del posizionamento virale e in fibra ottica.. Immagine di fluorescenza confocale acquisita su un microscopio a scansione laser SP5 Leica TCS è stato utilizzato per visualizzare il posizionamento della fibra (linea tratteggiata) e l&#39;espressione virale-mediata (verde) nel topo tegmentale ventrale seguente vivo stimolazione optogenetic in. Neuroni dopaminergici (TH +) sono visti in blu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Video 1. In stimolazione optogenetic vivo:. Iperattività durante VTA stimolazione utilizzando SSFO nei topi TH :: Cre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellsstimolazione = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tabella 1. irradianze luce necessaria per attivare opsine comunemente utilizzati. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsin Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> Densità di potenza (/ mm 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Proprietà </td></tr><tr><td> On / Off Kinetics </td></tr><tr><td colspan="5"> Eccitazione ottica: channelrhodopsins azione rapida </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mW </td><td> 1.21 / 12 msec </td><td> Incendi fino a 40 Hz </td></tr><tr><td> Cheta 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0.86 / 8.5 msec </td><td> Incendi fino a 200 Hz </td></tr><tr><td> Capo 20 </td><td> 450 </td><td> 1.65 mW </td><td> 1.62 / 12 msec </td><td> Forma non desensibilizzante di ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540nm) </td><td> 5/34 msec a 540nm </td><td rowspan="2"> Red-spostato </td></tr><tr><td> 3.2 mW (630nm) </td><td> 67 msec (in) a 630nm </td></tr><tr><td colspan="5"> Eccitazione ottica: azione lenta rhodopsins canale </td></tr><tr><td> Stabile funzione gradino opsin (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8? W (470nm) </td><td> 20 msec / 29 min </td><td> Nuova variante OFS; Stato è più aperto. Aperto da 470 nm, chiuso da 590 nm </td></tr><tr><td colspan="4"> Inibizione Optical </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2.5 msec / &lt;10 msec </td><td> Inibizione sostenuta per 30 min 22 con luce costante * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 msec </td><td> Più sensibile con fotocorrenti più grandi rispetto eNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Questa tabella è fornita solo come guida; specifiche irradianze luce necessaria per la modulazione neurale dovrebbero essere confermati in modo indipendente. </td></tr><tr><td colspan="5"> Validazione sperimentale è importante verificare che il opsin, strategia di targeting, e parametri di stimolazione della luce modulano cottura neurale nel modo previsto 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> Densità di potenza (mW / mm 2) si riferisce alla potenza della luce di illuminazione in una data area di tessuto cerebrale e non si riferisce alla potenza luminosa emessa dalla punta della fibra. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Utilizzare sempre l&#39;intensità di luce più basso possibile, soprattutto con stimolazione luminosa prolungata. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. irradianze luce necessaria per attivare opsine comunemente utilizzati. Abbreviazioni AAV = virus adeno-associato DPSS = stato solido pompato a diodi <br/&gt; EYFP = maggiore proteina fluorescente gialla FC / PC = fendi piatto / contatto fisico GFP = proteina fluorescente verde PBS = tampone fosfato PVC = polivinilcloruro mW = milliwatt NA = apertura numerica SSFO = stabile step-funzione opsin TH = tirosina idrossilasi TTL logica = transistor-transistor V = tensione VTA = area tegmentale ventrale

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In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

59.0K Views.  University of Pittsburgh Medical Center. Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Video: In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Ricerca

Neuroscienze

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Resezione del nervo ottico: un modello di apoptosi Neuron adulti nel Sistema Nervoso Centrale

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...