Ringraziamo il Dott. Randy Chitwood per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Whitehall e la Alfred P. Sloan sovvenzioni della Fondazione per HJK.

1. Configurazione ottica (Figura 1) <ol><li> Per eccitazione a due fotoni un sistema a infrarossi laser pulsato con impulsi a femtosecondi viene utilizzato. Un laser ad alta potenza di uscita (in alcuni casi&gt; 2W a 890 nm) è necessario per compensare le perdite introdotte dai grandi componenti ottici del sistema. </li><li> Un sistema prechirper costituito da due prismi conferisce un negativo dispersione di velocità di gruppo (GVD) sulle impulsi laser prima delle acusto-ottici deflettori (AOD) per compensare la dispersione temporale introdotta dalla AOD 1. </li><li> Due AOD con grandi aperture (10 mm per un obiettivo 40x immersione in acqua con NA 0,8) deviare il fascio laser in due dimensioni. </li><li> Un reticolo di diffrazione riflettente con 100 alberi / mm è situata 13 cm dietro le AOD da compensare la dispersione spaziale introdotto AOD usando brevi impulsi laser. </li><li> Il raggio laser è diretto con due telescopi relè alla porta fotocamera di un montante microscope. </li><li> Iridi sono posti a intervalli regolari per l&#39;allineamento delle ottiche. </li><li> Un separatore di fascio dicroico davanti all&#39;obiettivo trasmette la luce infrarossa di eccitazione al campione e riflette la luce di fluorescenza dal campione su un rivelatore. </li><li> Rilevatori di Epi-e transfluorescence (fotomoltiplicatori, PMT) raccogliere segnale di fluorescenza attraverso l&#39;obiettivo e - se del caso - attraverso il condensatore. </li><li> Filtri di vetro colorato (BG-39, 3-5 mm) sono posti davanti ai rivelatori per impedire alla luce di eccitazione raggiunge i rivelatori. </li><li> Gli angoli di deviazione AOD sono controllati da un computer dotato di un convertitore digitale-analogico-convertitore bordo (156,25 frequenza di clock kHz), che a sua volta aziona oscillatori controllati in tensione. </li><li> Il segnale dai fotomoltiplicatori viene trasmesso attraverso un passa basso Butterworth filtro (cut-off frequenza di 100 kHz) e digitalizzato da un convertitore analogico-digitale-convertitore (156,25 frequenza di clock kHz) prima di essere memorizzati inun computer per l&#39;analisi. </li><li> Allineamento e disturbi elettrici sono testati registrando la distribuzione dei segnali di fluorescenza con e senza luce laser, a guadagno alto e basso dei fotomoltiplicatori, nonché con e senza indicatore. Lo scanner è impostata correttamente e schermato quando la larghezza della distribuzione dei segnali di fluorescenza ad alto guadagno e con indicatore è molto più grande della larghezza delle altre distribuzioni di segnali di fluorescenza (Fig. 2). </li></ol> 2. Procedure sperimentali <ol><li> Retinato casuale scansione in accesso si basa sul riscontro di un aumento del calcio intracellulare. Un gran numero di neuroni possono essere colorate usando bolo della forma estere di un indicatore di calcio (per esempio Oregon verde 488 Bapta-1 AM) nel tessuto neurale 5. </li><li> Parecchie posizioni di ogni soma neurone vengono registrati, ciascuno per un breve periodo di tempo (&quot;dithering&quot;, 4 punti, 6.4 ms per ogni posizione = 25,6 ms per il tempo di registrazione each neurone in ogni ciclo, Fig. 3C). Per selezionare i neuroni di interesse un telaio completo composto da 256x256 pixel sia acquisito (Fig. 3A). Il centro di ogni neurone soma da registrare viene selezionata manualmente all&#39;interno di questa immagine. Il software di controllo aggiunge automaticamente tre punti a distanza di 2 micron intorno a questo centro. </li><li> In ciascun ciclo, viene registrato il segnale di fluorescenza da ciascuno dei 40 neuroni (Fig. 3B). Questo processo viene ripetuto per l&#39;intera durata di una registrazione (5 registrazione secondo = 3255 cicli, 1 ciclo = 1,536 ms). </li></ol> 3. Strumenti software online per massimizzare l&#39;efficienza di rilevamento picco <ol><li> Rilevamento di picco di fluorescenza segnali di calcio somatiche si basa su un alto rapporto segnale-rumore (S / N) dei segnali di calcio fluorescenza somatici. Un alto S / N può essere ottenuto aumentando intensità di eccitazione. Intensità di eccitazione, tuttavia, non può essere aumentata fino ad un certo limite a causa di radiazioni solari. Rilevamento Spike è alto all&#39;interno di un windo molto piccolow di intensità di eccitazione solo se segnali di fluorescenza hanno un alto S / N, ma solo fotodanneggiamento molto poco si osserva 3. Al fine di garantire che i segnali registrati sono all&#39;interno della finestra di rilevamento ad alta spike durante registrazioni monitoriamo tasso fotoni (vedi equazione 3.2) e declino basale fluorescenza usando analisi online. </li><li> Tasso di fotoni approssimativo per neurone è calcolata da un intervallo di tempo breve (100-200 ms) di rumore di base. Numero di fotoni (N λ) e fotone rate (λ = λ N / At) viene calcolato in base ai valori di fluorescenza inserendo la distribuzione (σ) delle relative variazioni di fluorescenza con la seguente equazione: </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" /> Questa equazione rappresenta la distribuzione di Poisson per il rumore photon shot con un cambio di variabile relativa variazione di fluorescenza: Af / F = (G * N λ (t)-G * N &amp; lambda,, 0) / G * N λ, 0 dove G indica il guadagno cumulativo di fotomoltiplicatore e di tutti gli altri componenti elettronici. Si noti che questa equazione non determina correttamente il numero di fotoni rivelati per registrazioni in vivo perché ci sono altre fonti di rumore (artefatti da movimento), oltre al rumore di sparo fotoni. Tuttavia questa equazione è utile per registrazioni in vivo per stimare il rumore. <ol start="3"><li> Fluorescenza basale è calcolata dalla finestra contemporaneamente e riportati in funzione del tempo o prove. Il calo medio della linea di base viene mantenuto al di sotto di 0,0002 / s per la regolazione della potenza del laser per il rilevamento picco declina rapidamente in caso di superamento di questo limite. </li><li> Ogni 10-20 minuti le posizioni somata neuroni vengono verificati dai nuovamente l&#39;acquisizione di una immagine full frame. Se necessario, le posizioni di registrazione sono regolati. Località può essere regolata per tutti i neuroni in una volta, o per singoli neuroni. </li></ol> 4. Reconstruction di temporizzazioni spike di segnali di fluorescenza (deconvoluzione) <ol><li> I segnali di fluorescenza derivanti da attività neurale spesso sommare nel tempo a causa del decadimento dei transienti di calcio è lungo (diverse centinaia di millisecondi). Un metodo di deconvoluzione ricostruisce tempi e spike spike da segnali di fluorescenza. </li><li> Per determinare il treno più probabile spike sottostante il segnale registrato di fluorescenza, modelli differenti vengono confrontate. Qui abbiamo usato un algoritmo genetico per determinare il modello - e quindi il treno picco e tempi spike - con la massima verosimiglianza. </li><li> Nelle popolazioni di neuroni non omogenei, il picco-evocato segnale di calcio può variare tra i neuroni. Per l&#39;analisi dei dati incontrollato imposta abbiamo progettato un algoritmo che tiene conto della variazione del segnale calcio-spike evocata da neurone a neurone. </li><li> Per evitare un gran numero di rilevazioni di falsi positivi è utile costringere l&#39;ampiezza consentita e tempo costante di decadimento del modello di spike-evocato segnale calcio. La distribuzione congiunta di tempo e ampiezza costante di decadimento del singolo spike transienti di calcio evocati sono registrati in una serie separata di esperimenti dello stesso tipo di neuroni nelle stesse condizioni sperimentali utilizzando simultanee registrazioni elettrofisiologiche e ottici. </li><li> Per tenere conto dei cambiamenti di base lenti e per ridurre i costi computazionali di deconvolving, registrazioni più lunghe sono suddivisi in diverse tracce più brevi di 1-5 secondi. </li><li> Per ogni neurone e ogni registrazione, l&#39;algoritmo di deconvoluzione può verificare un gran numero di modelli (fino a 1.000.000 diversi modelli o più). Per accelerare deconvoluzione, un esperimento è deconvolved su un massimo di 10 computer diversi in parallelo. </li><li> Dopo deconvoluzione, i dati vengono analizzati e punta ispezionato. A peri-stimolo istogramma tempo, probabilità picco e frequenza di scarica (picco medio per i neuroni) sono calcolati in modo automatico. </li></ol> 5.Risultati rappresentativi Successo cerniere rilevazione spike su un alto rapporto segnale-rumore rapporto tra i segnali registrati fluorescenza calcio somatiche. Semplicemente utilizzando i tassi di eccitazione ad alta potenza del laser (elevata) può causare un impatto negativo della photoeffects su materiale biologico (radiazioni solari). In retinato ad accesso casuale fotodanneggiamento scansione si manifesta come diminuzione fluorescenza basale e diminuisce dei segnali di calcio spike-evocati fluorescenza. La diminuzione del segnale spike-evocata può rapidamente determinare un errore per rilevare i picchi. C&#39;è solo una finestra molto piccola di intensità di eccitazione in cui la rilevazione picco di segnali di fluorescenza è alto. Sull&#39;estremità superiore questa finestra è limitata da fotodanneggiamento, sull&#39;estremità inferiore dei segnali di fluorescenza hanno un basso rapporto segnale-rumore. Per i neuroni corticali in fettine acute usiamo potenza del laser con conseguente tasso di fotoni di circa 400,000-1,500,000 fotoni / s quando si registra a circa 100 micron sotto la superficie fetta. Quando si utilizza un elevato-Indicatore di affinità - qui Oregon verde 488 BAPTA - 1 - il segnale è sufficiente per rilevare picchi individuali. Fig. 3E mostra un esempio di un segnale di fluorescenza rilevati al tasso di eccitazione molto bassa, un esempio di registrazione all&#39;interno della finestra di rivelazione, e uno al tasso di eccitazione molto alto. Rispetto ad altre tecniche per registrare l&#39;attività neurale con risoluzione di singola cellula e single-spike, dithering casuale la scansione in accesso è possibile registrare da un maggior numero di neuroni della stessa popolazione locale, ed è meno invasiva, ad esempio rispetto a tetrodo / multielettrodo registrazioni . Così dithered accesso casuale scansione può essere utilizzato per registrare l&#39;attività neurale da molti neuroni per misurare le informazioni reciproca segnalato da attività suprathreshold 6 (Fig. 4A), cambiamenti di attività neurale in una popolazione di neuroni (plasticità corticale), e la propagazione dell&#39;attività suprathreshold attraverso popolazioni di neuroni 14 (Fig. 4B) <img<html> alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Disegno ottico del dithering casuale configurazione scansione in accesso. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" /> Figura 2 Allineamento e test:. Distribuzioni di segnali di fluorescenza registrati in condizioni diverse. A) Nessuna luce laser e guadagno fotomoltiplicatore basso, B) al guadagno PMT più alta, ma non la luce laser, la distribuzione è più ampia a causa della corrente fotomoltiplicatore al buio. C) Con il laser e registrato a guadagno PMT alta. Una differenza tra le distribuzioni in B e mostrati in questa distribuzione indicherebbe che la luce di eccitazione raggiunge i rivelatori PMT. D) La distribuzione dei segnali di fluorescenza registrate ad alto guadagno da neurone somata. Se non altro contribuisce sorgente di rumore, questa distribuzione nasce dalla fotone colpo-solo rumore. . Jpg &quot;/&gt; Figura 3 A) immagine full frame fluorescenza per individuare e selezionare le posizioni somata neurone, B) il percorso di scansione di un ciclo, C) Illustrazione del principio di dithering,. (In ogni cerchio) località soma diversi sono registrati prima di spostare il fascio al successivo soma, D) Illustrazione dell&#39;uscita dei due D / A canali. Per ogni soma neurone, segnale di fluorescenza viene registrato da 4 punti diversi in ogni soma (S1-S4). La posizione di ciascun punto è dato dalla sua posizione xey. Le posizioni X e Y per tutte le macchie e tutti i neuroni sono inviati al digitale-analogico convertitore in modo sequenziale. Mentre il fascio viene spostato tra due somata neurone, nessun segnale viene acquisito (vuoto). E) Esempi di segnali di fluorescenza. Si noti che ogni esempio mostra risposta ad uno spike (come misurato con elettrofisiologico cell-registrazione allegata). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" /> Figura 4. Studiare cortifunzione cal con dithering casuale scansione in accesso. A) Misura informazione reciproca segnalato da popolazioni di neuroni. Immagine superiore mostra microfotografia di una fetta cerebrale acuto e due pipette stimolazione inseriti nella stessa colonna corticale a livello 4 (L4). Centro grafici mostrano risposte neurali per ogni ripetizione di uno stimolo. Bassa grafico mostra informazione reciproca di Shannon segnalato dalla popolazione registrata di neuroni. B) la propagazione di misura di attività suprathreshold chiodare (propagazione del segnale) tra le popolazioni di neuroni corticali. Grafico superiore illustra disegno sperimentale, immagine centrale mostra immagine di fluorescenza, le linee tratteggiate indicano confini barile, inferiore grafico mostra picchi rilevati in risposta alla stimolazione elettrica delle fibre talamo (triangoli).

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+neuronal+spiking+activity+from+unbiased+populations+of+neurons+with+high+spike+detection+efficiency+and+high+temporal+precision.">Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision.</a> J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).</li><li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision.">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+cortical+plasticity+on+information+signaled+by+populations+of+neurons+in+the+cerebral+cortex.">Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex.</a> J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).</li><li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo.">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li><li>Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+relationships+between+spiking+and+[Ca2+]i+in+neurons+of+the+Xenopus+tadpole+olfactory+bulb.">Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb.</a> J. Physiol. 582, 163-175 (2007).</li><li>Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. 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M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spike+inference+from+calcium+imaging+using+sequential+Monte+Carlo+methods.">Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods.</a> Biophys. J. 97, 636-655 (2009).</li><li>Yaksi, E., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+firing+rate+changes+across+neuronal+populations+by+temporally+deconvolved+Ca2++imaging.">Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging.</a> Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).</li><li>Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro.">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).</li><li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+decrease+with+propagation+of+spiking+activity+in+the+mouse+barrel+cortex.">Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex.</a> Front Neural Circuits. 5, 8 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Retinato ad accesso casuale la scansione rileva indirettamente attività suprathreshold spiking dagli aumenti del calcio intracellulare somatico associato ad ogni picco di un somata neurone. Gli aumenti di calcio intracellulare sono rilevati da coloranti fluorescenti di calcio. Le limitazioni di dithering accesso casuale scansione derivano principalmente dalla limitata del segnale-rumore dei segnali di fluorescenza del calcio. Il rapporto segnale-rumore è a sua volta limitato da fotodanneggiamento, che non consente di ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Componenti ottici sono elencati in ordine, partendo dal laser </td></tr><tr><td> Titan: Sapphire Laser </td><td> Coherent Inc. </td><td> Chameleon Ultra 2 </td><td> Alta potenza di uscita consigliata (&gt; 2W a 900 nm) </td></tr><tr><td> Lente acromatica f = 30 mm </td><td> Thor laboratori </td><td> AC254-030-B </td><td> Antiriflesso (AR) di rivestimento per 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromatica f = 100 mm </td><td> Thor laboratori </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> lenti f = 75 mm </td><td> Thor laboratori </td><td> LA1608-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> lenti f = 175 mm</td><td> Thor laboratori </td><td> LA1229-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromatica f = 300 mm </td><td> Thor laboratori </td><td> AC254-300-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromatica f = 100 mm </td><td> Thor laboratori </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Lente acromatica f = 100 mm </td><td> Thor laboratori </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Acusto-ottico deflettori </td><td> Intraaction Corp </td><td> ATD 6510CD2 </td><td></td></tr><tr><td> Diffrazione riflettente </td><td> Newport </td><td> 53-011R </td><td> 100 scanalature / mm per AOD con 65 MHz di larghezza di banda e l&#39;angolo di scansione di 45 mrad </td></tr><tr><td> 21,6 millimetri Brewster prismi </td><td> Lambda Research Optics Inc. </td><td> IBP21.6SF10 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro colorato </td><td> Schott </td&gt; <td> BG-39 </td><td></td></tr><tr><td> Specchio dicroico </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> Z532RDC </td><td></td></tr><tr><td> Fotomoltiplicatori moduli </td><td> Hamamatsu </td><td> H9305-03 </td><td></td></tr><tr><td> DAC-ADC bordo </td><td> National Instruments </td><td> PCI-6115 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon verde 488-Bapta 01:00 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6807 </td><td></td></tr></tbody></table>

optical recording of suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution

Segnalazione di informazioni nel sistema nervoso centrale dei vertebrati sono spesso realizzate da popolazioni di neuroni anziché singoli neuroni. Anche propagazione dell&#39;attività suprathreshold spiking coinvolge popolazioni di neuroni. Gli studi empirici riguardanti funzione corticale direttamente quindi richiedono registrazioni da popolazioni di neuroni ad alta risoluzione. Qui si descrive un metodo ottico e un algoritmo di deconvoluzione per registrare l&#39;attività neurale da un massimo di 100 neuroni con risoluzione di singola cellula e single-picco. Questo metodo si basa sul rilevamento degli aumenti transitori delle concentrazioni di calcio intracellulare somatica associata a punte suprathreshold elettrici (potenziali d&#39;azione) in neuroni corticali. Alta risoluzione temporale delle registrazioni ottiche viene raggiunto da un rapido accesso casuale tecnica di scansione utilizzando acusto-ottici deflettori (AOD) 1. A due fotoni di eccitazione dei risultati di calcio-colorante sensibile in alta risoluzione spaziale in tis cerebrali opachicitare in giudizio 2. Ricostruzione delle punte delle registrazioni di calcio fluorescenza viene raggiunto da un metodo di massima verosimiglianza. Simultanee registrazioni elettrofisiologiche e ottiche indicano che il nostro metodo rileva con sicurezza picchi (&gt; 97% efficienza di rivelazione spike), ha un basso tasso di falsi positivi spike (&lt;0,003 spikes / s), e una elevata precisione temporale (circa 3 ms) 3. Questo metodo ottico di rilevazione spike può essere utilizzato per registrare l&#39;attività neurale in vitro e in vivo in animali anestetizzati 3,4.

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Comprensione della funzione del sistema nervoso centrale dei vertebrati richiede registrazioni da molti neuroni perché funzione corticale pone a livello di popolazioni di neuroni. Qui si descrive un metodo ottico per registrare l&#39;attività neurale suprathreshold con risoluzione di singola cellula e single-spike, dithering casuale scansione in accesso. Questo metodo registra somatiche segnali di calcio di fluorescenza da un massimo a 100 neuroni con alta risoluzione temporale. Un algoritmo di massima verosimiglianza deconvolves l&#39;attività sottostante suprathreshold neurale dai segnali di calcio fluorescenza somatiche. Questo metodo rileva affidabile picchi con alta efficienza di rivelazione e un basso tasso di falsi positivi e possono essere utilizzati per studiare popolazioni neuronali<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt;.

Registrazione ottica di attività neurale suprathreshold con risoluzione singola cellula e single-picco

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Views.  The University of Texas at Austin. Comprensione della funzione del sistema nervoso centrale dei vertebrati richiede registrazioni da molti neuroni perché funzione corticale pone a livello di popolazioni di neuroni. Qui si descrive un metodo ottico per registrare l'attività neurale suprathreshold con risoluzione di singola cellula e single-spike, dithering casuale scansione in accesso. Questo metodo registra somatiche segnali di calcio di fluorescenza da un massimo a 100 neuroni con alta risoluzione t...

Video: Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Impianto chirurgico di elettrodi neurali cronici per la registrazione di attività singola unità e segnali Electrocorticographic

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Ricerca

Neuroscienze

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Neural Activity Propagazione in ippocampale preparazione piegato con un penetrante Micro-elettrodo Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

Fabbricazione di High Contact-Density, Flat-Interface Elettrodi nervose per la registrazione e la stimolazione Applicazioni

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analizzando l'attività neurale e connettività utilizzando dati EEG intracranico con SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Registrazione ottica a singolo fotone a campo largo nelle sezioni cerebrali utilizzando Colorazione sensibile alla tensione

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...