Vogliamo in particolare ringraziare i membri del laboratorio di Gerber per le istruzioni tecniche per la loro impostazione sperimentale e commenti sul manoscritto. Ringraziamo anche Lyubov Pankevych per la cura della mosca e la manutenzione del parco selvaggio Cantoni tipo. Questo lavoro è supportato dalla concessione DFG TH1584/1-1, la concessione SNF 31003A_132812 / 1 e la Zukunftskolleg dell&#39;Università di Costanza (tutti a AST).

1. Preparazione <ol><li> Drosophila wild-type larve vengono sollevate a 25 ° C e 60% ​​-80% di umidità in un ciclo di 14/10 chiaro / scuro. Per controllare l&#39;età esatta delle larve sempre 20 femmine sono messi con 10 maschi in un flaconcino (6 cm di altezza e 2,5 cm di diametro) che include circa 6 ml di cibo mosca standard. Le mosche possono deporre le uova per 12 ore e sono trasferiti in un nuovo flaconcino il secondo giorno. 5-6 giorni dopo la deposizione delle uova larve raggiungere l&#39;alimentazione 3 ° fase instar se sollevato a 25 ° C e può essere utilizzata per l&#39;esperimento comportamentale. Tuttavia, si deve assicurare prendere solo larve che sono ancora in cibo non e le larve dal lato del flaconcino. Queste larve hanno già raggiunto il &quot;vagabondaggio 3 ° fase instar&quot; - poco prima impupamento - e il loro impiego complica l&#39;interpretazione dei risultati. </li><li> Preparazione del 2,5% agarosio capsule di Petri (altri laboratori utilizzare anche le concentrazioni di agar all&#39;1% per tutto l&#39;esperimento, comeconcentrazioni sempre più basse possono consentire l&#39;alimentazione 3 ° larve instar a scavare nel substrato): Sciogliere 2,5 g di agarosio in 100 ml di DDH 2 O. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire. Agitare con cura la soluzione e rimetterlo nel forno a microonde fino a quando tutti agarosio è sciolto. Versare la soluzione calda di agarosio in piastre Petri tali che il fondo delle piastre di Petri è completamente coperto e la soluzione di agarosio forma una superficie liscia. Lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e chiudere i coperchi. Non immediatamente chiudere i coperchi, perché consentirebbe per la condensazione di acqua ai coperchi. </li><li> Preparazione di 2M fruttosio piastre di Petri: sciogliere 2,5 g di agarosio in 100 ml di DDH 2 O (ancora una volta, l&#39;uso della concentrazione di agar 1% è possibile, ma può autorizzare l&#39;alimentazione 3 ° larve instar a scavare nel substrato). Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando non inizia a bollire. Agitare con cura la soluzione e rimetterlo nella microonda finché tutto agarosio è sciolto. Aggiungere con cautela 35 g di fruttosio nella soluzione calda, lentamente agitare la miscela fino a quando lo zucchero è sciolto per evitare ritardo ebollizione. Versare il fruttosio hot-agarosio soluzione in piastre Petri tali che il fondo è completamente coperto e il fruttosio-agarosio soluzione forma una superficie liscia. Lasciar raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e chiudere i coperchi. Non immediatamente chiudere i coperchi, perché consentirebbe per la condensazione di acqua ai coperchi. </li><li> Preparazione di 1-ottanolo (OCT) contenitori odore: riempire 10 ml di puro ottobre in un contenitore su misura odore teflon e chiudere con un coperchio che ha diversi piccoli fori per consentire l&#39;evaporazione dell&#39;odore. Una descrizione dettagliata dei contenitori viene dato in Gerber e Stocker 2007. Preparare tre contenitori odore di ottobre Contenitori odore consentire l&#39;evaporazione delle sostanze chimiche inseriti, ma evitare che le larve possono contattare direttamente loro. Pertanto, gli esperimenti qui descritti specificamenteaffrontare l&#39;apprendimento olfattivo nelle larve senza perturbare effetti collaterali gustative. </li><li> Preparazione di Amilacetato (AM) contenitori odore: Diluire AM 1:50 in olio di paraffina. Riempire 10 ml di diluizione in un contenitore personalizzato fatto odore Teflon e chiudere con un coperchio che ha diversi piccoli fori per consentire l&#39;evaporazione dell&#39;odore. Preparare tre contenitori odore per AM. La diluizione è importante per ragioni pratiche, ossia evitare una forte preferenza per uno sopra l&#39;altro odore che può mascherare un apprendimento dipendente dalla variazione nella preferenza relativa tra i due odori. L&#39;attrazione uguale per entrambi gli odori possono devono essere confermati in laboratorio prima che l&#39;esperimento applicando il test in seguito descritto (2.5) con gli animali naïve. Il valori qui presentati si basano su varie pubblicazioni del laboratorio di Gerber che sono stati recentemente riprodotti dal nostro laboratorio 9,15,16. </li><li> Etichettatura delle piastre di Petri: prima gli esperimenti comportamentali tutte le piastre di Petri devono essere codificati. Ciò significa chefruttosio contenente piastre di Petri devono essere contrassegnati, ad esempio con una &quot;X&quot; oppure un &quot;A&quot; e agarosio solo piastre di Petri con una &quot;Y&quot; o &quot;B&quot;. Questo codice deve essere rivelato al sperimentatore solo dopo che tutti i dati siano stati registrati. Eseguendo gli esperimenti &quot;cieco&quot; non è dunque possibile che le aspettative del sperimentatore può influire sulle prestazioni delle larve. Per facilitare la comprensione per i lettori ampio seguito si parla solo gli odori come stimoli condizionati (CS1 e CS2), che siano ricompensati quando viene presentato su un piatto Petri fruttosio (+) o non-premiata quando ha presentato su un solo agarosio Petri (-). </li></ol> 2. Zucchero Training Ricompensa e Test <ol><li> Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Trasferirli ad un primo piatto Petri contenente alcune gocce di acqua di rubinetto e con cura muoversi avanti e indietro con un pennello. Trasferimento ad un secondo piatto di Petri che contiene anche alcune gocce di rubinetto water per controllare che non pasta alimentare rimane sul bodywall delle larve, altrimenti le larve sarebbe in grado di provare l&#39;odore cibo durante l&#39;esperimento. Ciò probabilmente oscurare il processo di apprendimento e le loro prestazioni in situazione di test. </li><li> Formazione: Formare larve di odori associati con una stecca di zucchero appetitivo il seguente regime viene applicato. Posizionare un contenitore odore ottobre sul lato sinistro e destro di una &quot;X&quot; segnato - in tal modo, ricompensa contenente fruttosio (+) Petri (esperimento &quot;cieca&quot;, per i dettagli vedere 1.6). Posizionare il gruppo di alimentazione 30 3 rd larve instar sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere 5 min, mentre gli animali sono esposti a ottobre Assicurarsi che le larve non sono intrappolati all&#39;interno della goccia d&#39;acqua e può superare la tensione superficiale di esso. Con che le larve possono muoversi liberamente sulla piastra di Petri e sperimentare stimoli olfattivi e / o gustativa. </li><li> Formazione: Rimuovere le larve dalla piastra di Petri con un pennello inumidito e trasferire ilm su un secondo piatto Petri che è etichettato con una &quot;Y&quot; - quindi, solo agarosio (-) contenente piastra Petri - e ha un contenitore AM odore situato sul lato sinistro e destro. Chiudere il coperchio e attendere 5 min, mentre gli animali sono esposti a AM. </li><li> Formazione: Ripeti 2.2) e 2.3) per due volte, in modo tale che tutte le larve di 30 Esperienza tre cicli di formazione: CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-); CS1 / (+) - CS2 / (-). In questo esperimento rappresenta ottobre CS1 e CS2 codici per AM. </li><li> Test: Un posto AM e un contenitore odore ottobre sui siti opposti di un agarosio sola piastra di Petri. Trasferire gli animali addestrati al centro del piatto di prova Petri. Chiudere il coperchio ed attendere 5 min. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, il lato destro e centrale del piatto di prova Petri. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.1) a 2.5) con un secondo gruppo di 30 di alimentazione 3 ° larve instar ma scambiare i ruoli sperimentali di AM e PTOM, in modo tale che gli animali ricevano la formazione seguente: CS2/ (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-); CS2 / (+) - CS1 / (-). In questo esperimento rappresenta ottobre CS1 e CS2 codici per AM. </li><li> Modalità possibili per la formazione. Sopra vi presentiamo una formazione che esiste di tre studi di formazione di entrambi OCT / (+) - AM / (-) o nel gruppo di reciproca anche tre prove di formazione di AM / (+) - Ottobre / (-). Tuttavia, per evitare effetti sequenza dipendente durante la formazione è importante variare la sequenza degli stimoli in ripetizioni seguenti dell&#39;esperimento completo. Variando l&#39;ordine CS1 o CS2 e anche la presentazione ricompensa nella prima piastra o secondo presentato, quattro sequenze diverse per i processi di formazione sono possibili: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Primo gruppo </td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td><td> Reciproco gruppo </td><td> CS2 / (+) - CS1 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (+) - CS2 / (-) </td><td></td><td> CS1 / (+) - CS2 / (-) </td></tr><tr><td></td><td> CS2 / (-) - CS1 / (+) </td><td></td><td> CS1 / (-) - CS2 / (+) </td></tr></tbody></table> Per evitare effetti sistematici di stimoli nell&#39;ambiente circostante sperimentale, si dovrebbe effettuare la prova in una metà dei casi che ottobre viene presentato sulla sinistra e sulla destra AM. Nell&#39;altra metà dei casi AM devono essere presentati sulla sinistra e sulla destra ottobre. 3. I test per attività rilevanti per senso-motorie Facoltà La progettazione di esperimenti sopra descritti consente l&#39;analisi di odori zucchero apprendimento nel tipo selvatico alimentazione 3 ° larve instar da solo. Tuttavia, nella vita quotidiana ricercatori laboratorio solito usano due o più differenti gruppi sperimentali di larve di confrontare, se l&#39;apprendimento olfattivo dipende da una pargene colare, un insieme specifico di neuroni, uno stock mutante, una dieta speciale, diverse condizioni di allevamento, prodotti chimici tossici aggiunto durante lo sviluppo, ecc Così, in tutti i casi in cui due o più gruppi sperimentali di larve vengono testati si deve fare una serie di esperimenti di controllo obbligatorie per verificare, se i diversi gruppi di larve mostrano proprie senso-motorie acuità. Questo diventa obbligatorio come fenotipi potenziali non sono necessariamente a causa di capacità ridotta o abolita per gli odori associati con lo zucchero. Piuttosto, i potenziali difetti di apprendimento potrebbe essere basato su difetti in ogni fase del circuito senso-motorio nella lavorazione di odori e / o zucchero. O in altre parole, se una larva mutante non è in grado di zucchero senso, non è possibile stabilire una memoria zucchero. Ma questo non consente di concludere che la larva non può imparare. In particolare i seguenti esperimenti di controllo devono essere fatte per testare il corretto PTOM, AM e la trasformazione di fruttosio di larve transgeniche. 1. Test per ingenuo ottobre preferiscarenza Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Mettere un contenitore odore ottobre su un lato di un piatto Petri agarosio, aggiungere le larve sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso l&#39;ottobre odore sorgente. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri. 2. Test per ingenuo preferenza AM Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Mettere un odore AM contenitore su un lato di un piatto Petri agarosio, aggiungere le larve sul centro del piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso l&#39;AM odore sorgente. Successivamente contare il numero di larvae sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri. 3. Test per la preferenza zucchero ingenuo Raccogliere 30 di alimentazione 3 ° larve instar da un flaconcino cibo. Lavare accuratamente con acqua corrente, come descritto al punto 2.1. Preparare piatti Petri contenenti 2,5% agarosio in una metà e una 2M fruttosio-agarosio miscela nell&#39;altra metà. Aggiungere le larve sul piatto Petri, chiudere il coperchio e attendere per 5 minuti, in modo tale che le larve possono strisciare sul piatto Petri e orientare verso il lato contenente fruttosio. Successivamente contare il numero di larve sul lato sinistro, al centro e sul lato destro del piatto di prova Petri. Preparazione di mezzo mezzo piastre di Petri: Preparare normali piastre di agarosio come descritto in precedenza nella sezione 1.2. Quando i pieni agarosio piastre Petri sono raffreddati, tagliare l&#39;agarosio lungo l&#39;asse verticale con un bisturi. Rimuovere una metà del agarosio dalla piastra Petri. Ladd un hot-fruttosio agarosio soluzione (per la preparazione cfr 1,3) al mezzo vuoto della piastra Petri. Fare attenzione che entrambe le metà partita e non formano un bordo definito - questo influisce sul comportamento larvale scelta e rende l&#39;analisi del comportamento piuttosto difficile. 4. Sham formazione Nonostante il test se l&#39;alimentazione transgenica 3 ° instar larve sono in grado di distinguere con un livello di selvaggia tra ottobre e aria (3.1), AM e aria (3.2) e lo zucchero e puro agarosio (3.3), un ulteriore set di esperimenti di prova è stato recentemente introdotto (per la discussione cfr. Gerber e Stocker, 2007). Il razionale di questi esperimenti è il seguente. Durante la formazione larve subiscono manipolazione massiccia e odore successive e zucchero stimolazione. Così, è ben possibile che il fenotipo osservato apprendimento è fuorviante (anche se l&#39;odore ingenuo e prove percezione zucchero sono con un livello selvaggio!). Infatti, è possibile che gli animali transgenici differ da larve wild type rispetto alla resistenza allo stress, la motivazione, la fatica, adattamento sensoriale, l&#39;apprendimento contestuale, e cambiamenti di sazietà. Così, Michels et al. (2005) ha introdotto controlli che verificare se un mutante dato è in grado di rilevare (1) AM rispetto a un contenitore vuoto odore se si trattano le larve esattamente come durante l&#39;allenamento, tranne che si omette il premio e solo esporre sia odori, (2) rilevare ottobre dopo che il regime stesso, (3) rilevano AM contro un contenitore vuoto odore, se si trattano le larve in una formazione simile modo a meno che si omette gli odori e semplicemente esporre la ricompensa, e (4 ) rilevano ottobre dopo lo stesso dosaggio. Per una discussione completa e ulteriori dettagli sui metodi di vedere Michels et al (2005) e Gerber e Stocker (2007). 4. Analisi dei dati per l&#39;apprendimento di zucchero Ricompensa <ol><li> Per valutare i dati del protocollo di apprendimento zucchero ricompensa calcolare un indice di preferenza OCT (PREF OCT) per ciascuno dei due reciprocitàgruppi automaticamente formati: Per il primo gruppo che ha ricevuto OCT / (+) - AM / (-) formazione: PREF OCT (OCT + / AM-) = (# di larve sul lato OTT - # di larve sul lato AM) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale Per il secondo gruppo che ha ricevuto AM / (+) - Ottobre / (-) formazione: PREF AM (AM + / OCT-) = (# di larve sul lato AM - # di larve sul lato ottobre) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale </li></ol><ol start="2"><li> Calcolare un indice di prestazione (PI) per i due valori PREF da 4.1). Il PI rappresenta apprendimento associativo da annullando effetti perturbatori di odore e di esposizione punizione, passare del tempo e la gestione: PI = (PREF ottobre (OCT + / AM) + PREF AM (AM + / PTOM)) / 2 Così PI può variare da -1 a 1. Valori significativamente negativi rappresentano avversione di apprendimento, mentre valori significativamente positivi descrivere l&#39;apprendimento appetitiva. Un esperimento completo comprende di solito di 10 o più inibitori della proteasi. I dati sono visualizzati come sap casella di trameg tutti i valori di un determinato gruppo sperimentale. 50% dei valori essendo situato all&#39;interno della scatola, l&#39;indice di prestazioni mediana è indicata come una linea in grassetto nella particella casella. </li></ol> 5. Analisi dei dati per l&#39;attività rilevanti senso-motorie Facoltà <ol><li> Per valutare i dati durante il test per il corretto trattamento degli odori ottobre calcolo di un indice odore ottobre preferenze come segue: Odore PREF ottobre = (# di larve sul lato OTT - # di larve sul lato opposto) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale </li><li> Per valutare i dati durante il test per una corretta percezione degli odori AM calcolare un indice di odore AM preferenze come segue: Odore PREF AM = (# di larve sul lato AM - # di larve sul lato opposto) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale </li><li> Per valutare i dati durante il test per la percezione fruttosio corretto calcolare un indice di preferenza fruttosio come segue: PREF fruttosio = (# di larve lato fruttosio - # di larve dall&#39;altra) / N ° di tutte le larve all&#39;interno delle zone di sinistra, destra e centrale </li><li> Dettagli per la formazione farsa sono in Michels et al. 2005. </li></ol>

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Senses. , (2012).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+extrinsic+neurons+and+their+implications+in+the+functional+roles+of+the+mushroom+bodies+in+Drosophila+melanogaster+Meigen.">The organization of extrinsic neurons and their implications in the functional roles of the mushroom bodies in Drosophila melanogaster Meigen.</a> Learn Mem. 5, 52-77 (1998).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane/juxtamembrane+domain-dependent+Dscam+distribution+and+function+during+mushroom+body+neuronal+morphogenesis.">Transmembrane/juxtamembrane domain-dependent Dscam distribution and function during mushroom body neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 43, 663-672 (2004).</li><li>Robertson, K., Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Drosophila+embryonic+brain+development+using+photoactivated+gene+expression.">Dissecting Drosophila embryonic brain development using photoactivated gene expression.</a> Dev. Biol. 260, 124-137 (2003).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+functions+of+the+reaper+and+head+involution+defective+genes+in+the+programmed+cell+death+of+Drosophila+central+nervous+system+midline+cells.">Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midline cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).</li><li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons.">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis.">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li><li>Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+electrical+properties+in+Drosophila+neurons+developing+without+synaptic+transmission.">Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission.</a> J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).</li><li>Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+odor+similarity+"space"+in+larval+Drosophila.">A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).</li><li>Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+attractiveness+and+associative+learnability+of+odors+can+be+dissociated+in+larval+Drosophila.">Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).</li><li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae.">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. , (2011).</li><li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cAMP+response+element-binding+protein-dependent+medium-term+memory+by+appetitive+gustatory+reinforcement+in+Drosophila+larvae.">Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).</li><li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+neuronal+networks+and+biochemical+pathways+for+appetitive+and+aversive+memory+in+Drosophila+larvae.">Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).</li><li>Khurana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Conditioning+in+the+Third+Instar+Larvae+of+Drosophila+melanogaster+Using+Heat+Shock+Reinforcement.">Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement.</a> Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).</li><li>Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+through+metamorphosis+in+normal+and+mutant.">Memory through metamorphosis in normal and mutant.</a> 14, 68-74 (1994).</li><li>Michels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+site+and+molecular+mode+of+synapsin+action+in+associative+learning.">Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning.</a> Learn Mem. 18, 332-344 (2011).</li><li>Saumweber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+synaptic+plasticity+are+impaired+upon+lack+of+the+synaptic+protein+SAP47.">Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47.</a> J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186, 735-755 (2010).</li><li>Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+TRP+channels+are+required+for+warm+and+cool+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<html> La configurazione descritta in larve di Drosophila permette lo studio di apprendimento associativo olfattivo all&#39;interno di un cervello relativamente elementare. L&#39;approccio è semplice, economico, facile da stabilire in un laboratorio e non richiede attrezzature ad alta tecnologia 9. Vi presentiamo una versione dell&#39;esperimento, per studiare appetitiva apprendimento associativo rafforzato dalla ricompensa fruttosio 11. La configurazione descritta si basa su una serie di ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Numero CAS </td></tr><tr><td> Fruttosio </td><td> Sigma </td><td> 47740 </td><td> 57-48-7 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71350 </td><td> 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td> 9012-36-6 </td></tr><tr><td> 1-ottanolo </td><td> Sigma </td><td> 12012 </td><td> 111-87-5 </td></tr><tr><td> Amilacetato </td><td> Sigma </td><td> 46022 </td><td> 628-63-7 </td></tr><tr><td> Olio di paraffina </td><td> Sigma </td><td> 18512 </td><td> 8012-95-1 </td></tr></tbody></table>

appetitive associative olfactory learning in drosophila larvae

Nel seguito sono descritti i dettagli metodologici appetitiva apprendimento associativo olfattivo nelle larve Drosophila. La configurazione, in combinazione con interferenza genetica, fornisce una maniglia per analizzare i fondamenti neuronali e molecolari di apprendimento specificamente associativo in un cervello semplice larvale. I microrganismi possono utilizzare l&#39;esperienza passata per regolare il comportamento presente. Tale acquisizione del potenziale comportamentale può essere definito come l&#39;apprendimento, e le basi fisiche di questi potenziali come tracce di memoria 1-4. I neuroscienziati cercare di capire come questi processi sono organizzati in termini di cambiamenti molecolari e neuronali nel cervello, utilizzando una varietà di metodi in organismi modello che vanno dagli insetti ai vertebrati 5,6. Per tali sforzi, è utile usare sistemi di modelli che sono semplici e accessibili sperimentalmente. La larva Drosophila è rivelato soddisfare queste richieste basate sula disponibilità di solidi saggi comportamentali, l&#39;esistenza di una varietà di tecniche transgeniche e l&#39;organizzazione elementare del sistema nervoso che comprende solo circa 10.000 neuroni (anche se con qualche concessione: limitazioni cognitive, poche opzioni comportamentali, e la ricchezza di esperienza discutibile) 7-10 . Larve di Drosophila possono formare associazioni tra odori e appetitiva rinforzo gustativa come lo zucchero 11-14. In un saggio standard, stabilita nel laboratorio di Gerber B., gli animali ricevono due odore formazione reciproca: Un primo gruppo di larve è esposto ad un odore Un insieme ad un rinforzo gustativo (ricompensa zucchero) e viene successivamente esposto ad un odore B senza armatura 9. Nel frattempo, un secondo gruppo di larve riceve una formazione reciproca, mentre vivendo un odore senza armatura e, successivamente, di essere esposti a B odore con rinforzo (premio zucchero). In seguito entrambi i gruppi sono testa per la loro preferenza tra i due odori. Preferenze relativamente più elevati per l&#39;odore premiato riflettere apprendimento associativo - presentato come un indice di prestazione (PI). La conclusione in merito alla natura associativa dell&#39;indice di prestazione è convincente, perché a parte la contingenza tra odori e sostanze sapide, altri parametri, come ad esempio l&#39;odore e l&#39;esposizione ricompensa, passare del tempo e la gestione non differiscono tra i due gruppi di 9.

La figura 1A mostra una panoramica delle procedure sperimentali per l&#39;apprendimento olfattivo larvale associativo. Accoppiando uno dei due odori presentati con un premio larve zucchero acquisire il potenziale comportamento di esprimere una risposta attraente verso l&#39;odore ricompensati rispetto al unrewarded odore. Due gruppi di larve sono sempre formati da una associazione il rinforzo con l&#39;odore PTOM o AM. L&#39;indice di prestazioni (PI) misura la funzione associativa come la differenza di...

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Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Larve di Drosophila sono in grado di associare stimoli odore con la ricompensa gustativa. Qui descriviamo un semplice paradigma comportamentale che permette l&#39;analisi di appetitivo apprendimento associativo olfattivo.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

appetitive-associative-olfactory-learning-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

18.8K Views.  University of Konstanz. Larve di Drosophila sono in grado di associare stimoli odore con la ricompensa gustativa. Qui descriviamo un semplice paradigma comportamentale che permette l'analisi di appetitivo apprendimento associativo olfattivo.

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Learning Positivo Butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Ricerca

Neuroscienze

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Le larve

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

Una prova oggettiva e riproducibile di apprendimento olfattivo e discriminazione nei topi

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.