Utilizzando questo protocollo, i lisati cellulari batterici di alta qualità possono essere prodotti utilizzando solo apparecchiature di laboratorio comuni ampiamente disponibili, rendendo l'espressione genica senza cellule facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La combinazione dell'autolisi cellulare del programma con un ciclo di congelamento-disgelo o liofilizzazione consente di creare un approccio pratico, laborioso ed economico per una rapida produzione di lisati batterici per l'espressione genica senza cellule. Iniziare utilizzando un ciclo di inoculazione per strisciare le cellule di un ceppo di autolisi di E.coli su piastre di agar LB contenenti 50 microgrammi per millilitro ampicillina, quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno seguente, usando una punta di pipetta, prelevare una singola colonia dalla piastra di agar e aggiungerla in un tubo di coltura contenente LB medium con ampicillina. Coltiva questa cultura di avviamento a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere 400 microlitri della coltura di avviamento in un pallone Erlenmeyer da un litro contenente 400 millilitri di mezzo 2xYTPG integrato con 50 microgrammi per millilitro ampicillina.
Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 300 RPM. Utilizzando uno spettrofotometro e una cuvetta ottica con una lunghezza del percorso di un centimetro, misurare periodicamente la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Quando la densità ottica supera una, iniziare a diluire la coltura cinque volte prima delle misurazioni per garantire che le misurazioni rimangano all'interno dell'intervallo lineare di un tipico spettrofotometro da laboratorio.
Una volta che la densità ottica della coltura diluita a cinque volte raggiunge 0,3, rimuovere il matraccio dall'incubatrice e procedere alla preparazione del lisato. Per preparare il lisato, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.800 x g per 15 minuti a temperatura ambiente. Versare il surnatante e rimuovere il liquido rimanente usando una pipetta.
Aggiungere 45 millilitri di tampone S30A freddo al pellet e risospesciare il pellet mediante vortice. Quindi, pesare un tubo centrifugo vuoto da 50 millilitri prima di trasferire le celle nel tubo. Centrifugare nuovamente le cellule e scartare il surnatante.
Aspirare qualsiasi surnatante rimanente usando una pipetta. Pesare nuovamente il tubo e sottrarre il peso del tubo vuoto dal peso visualizzato per ottenere il peso del pellet. Per ogni milligrammo di pellet cellulare, aggiungere due microlitri di tampone S30A freddo integrato con due millimolari ditiotreitolo.
Quindi, risospese le cellule con un vigoroso vortice. Quindi, congelare le cellule mettendole in un congelatore negativo a 20 o 80 gradi Celsius negativo fino a quando il pellet non è completamente congelato, quindi scongelare le celle a bagnomaria a temperatura ambiente e vorticare vigorosamente per due o tre minuti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 45 minuti con agitazione a 300 RPM, quindi eliminare il campione di detriti cellulari pesanti centrifugando in tubi centrifughi trasparenti a 30.000 x g per 45 minuti a quattro gradi Celsius.
Trasferire con cura il surnatante in un tubo nuovo con una pipetta, avendo cura di non disturbare il pellet. Se il surnatante trasferito è contaminato da materiale del pellet, ripetere la centrifugazione. Trasferire il surnatante in tubi centrifughi da 1,5 millilitri.
E centrifuga ancora una volta a 21.000 x g o alla velocità massima di una centrifuga da tavolo per cinque minuti. Aliquotare l'autolisi eliminata nei volumi desiderati e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Per l'espressione genica senza cellule utilizzando l'autolizzato, mescolare otto microlitri di autolizzato e 8,9 microlitri di premiscela su ghiaccio.
Aggiungere DNA a una concentrazione finale di otto nanomoli, qualsiasi altro reagente necessario e acqua per ottenere un volume finale di 20 microlitri. Aggiungere la reazione a una micropiastra a 384 pozzetti e utilizzare un lettore di piastre per misurare il decorso temporale di fluorescenza e gli endpoint. L'espressione GFP utilizzando l'autolizzato con una serie di diluizioni di DNA plasmatico si traduce in una forte espressione anche con un DNA nanomolare.
Confrontando l'espressione GFP tra un lisato disponibile in commercio e l'autolizzato, l'autolizzato ha prodotto livelli comparabili di GFP. La variabilità tra lotti di lisato prodotti in due diversi laboratori da diversi ricercatori era di circa due volte. Le tre variabili più critiche sono il rapporto pellet/tampone cellulare, il trasferimento di surnatante privo di detriti e l'utilizzo di una concentrazione ottimale di PEG e magnesio nella reazione finale.
Una volta che l'estratto è stato preparato, è possibile utilizzare un ampio arsenale di protocolli esistenti sviluppati per i sistemi di espressione libera da cellule di E.coli, come la degradazione mediata da ClpXP o il quorum sensing mediato da AHL.
