Gli autori desiderano ringraziare l&#39;Ufficio di Ricerca della Presbyterian College School of Pharmacy per il sostegno finanziario di questo progetto attraverso il piccolo Farmacia Awards per la Ricerca &amp; Collaboration (SPARC) Award. Gli autori ringraziano John Smink, Responsabile del Laboratorio di Ricerca per gli animali acquatici, Clemson University, Clemson, SC per la sua tecnica di revisione assistenza manoscritto.

NOTA: Questi protocolli seguono le linee guida del IACUC di Presbyterian College. 1. Acquisire materiali elencati nella tabella 1. 2. Montare il 5 Shelf Chrome secondo le istruzioni del produttore. Questo verrà utilizzato per ospitare il Fondo. 3. Costruire il serbatoio di acqua e sistema di filtrazione (Figure 1A e 2). <ol><li> Utilizzando la Figura 1A come guida, il layout 18 gallone secchio, pompe, filtri e lampada UV per determinare la posizione di installazione finale e la dimensione. </li><li> Una volta che le parti sono disposte, misurare e tagliare il &quot;tubo di PVC ¾ alla lunghezza necessaria per il montaggio. Variare le lunghezze di tutti i tubi in base alle esigenze e alle limitazioni di spazio specifici. </li><li> Montare i tubi e raccordi come indicato in precedenza con il primer PVC e cemento, vedi sotto (3.3.2 e 3.3.3). <ol><li> Sand i bordi tagliati del tubo con carta vetrata fino a che non sono lisce al tatto unad non ci sono detriti. </li><li> Prime l&#39;esterno del tubo e l&#39;interno del raccordo con il primer PVC acquistato con il tampone incluso dal primer PVC. </li><li> Cemento tubo e raccordo insieme applicando cemento PVC all&#39;esterno del tubo utilizzando il tampone inclusa. Ripetere l&#39;operazione per tutti i passi che devono cementazione PVC. </li><li> Posizionare il secchio 18 gallone ad un lato della costruzione mensola. </li><li> Installare un connettore paratia lato del serbatoio. </li><li> Collegare un &quot;tubo di PVC ¾ alla paratia. </li><li> Collegare l&#39;altra estremità del ¾ &quot;tubo della pompa con un ¾&quot; filettato fare raccordo. </li><li> Collegare i filtri per la pompa con due gomiti 90 gradi e ¾ &quot;tubo di PVC. <ol><li> Utilizzare un filtro di carta seguito da uno filtri a carboni attivi per filtrare detriti e ridurre i livelli di cloro e chimici nell&#39;acqua. </li></ol></li><li> Collegare la lampada UV al filtri According per le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Fissare la pompa e il sistema di filtro per il lato superiore del primo ripiano del rack utilizzando fascette. Variare l&#39;ordine del montaggio e fissaggio secondo la dimensione e la disposizione del ripiano / cremagliera prescelto. </li><li> Aggiungere 1 Bioball per litro d&#39;acqua al serbatoio di acqua quando la pompa e il sistema di filtro sono assemblati e fissati alla mensola. </li></ol> 4. Costruire la linea principale di alimentazione (Figure 1B e 2). <ol><li> Misurare e tagliare un pezzo di ¾ &quot;tubo di PVC per collegare la lampada UV alla rete principale </li><li> Utilizzare un ¾ &quot;tee PVC per avviare la linea di alimentazione principale collegando il tee al ¾&quot; gas di scarico in PVC proveniente dal filtro UV. . <ol><li> Aggiungere una valvola on-off sul fondo del tee PVC per servire come uno scarico per lavaggio manutenzione del sistema. </li><li> Avviare la linea di alimentazione principale dalla parte superiore del ¾ &quot;tee PVC misurando e taglio ¾&quot; PVCtubo alla lunghezza desiderata per fornire tubi di alimentazione per ciascuno dei ripiani sulla cremagliera. </li><li> Installare ¾ &quot;tee PVC per le linee orizzontali che entreranno ogni ripiano del rack. </li><li> Opzionalmente (e suggerito), aggiungere una ¾ &quot;on-off valvola per ciascuna linea di alimentazione mensola per consentire l&#39;isolamento di ogni ripiano e un design modulare del sistema. </li></ol></li><li> Utilizzare un &quot;tubo di PVC ¾ come un riduttore di linea sul ripiano superiore. Se questa linea corre sul retro del ripiano, utilizzare questa mensola per immagazzinaggio. Terminare la linea di riduzione della pressione nella linea di scarico principale (Figura 1B) con un ¾ &quot;valvola on-off. </li><li> Una volta che i passi precedenti sono stati completati, primo e cementare il tubo in PVC insieme come fatto in precedenza quando si costruisce il sistema di serbatoio e filtrazione. </li></ol> 5. Costruire la linea principale di scarico (Figure 1C e 2). <ol><li> Eseguire la lunghezza verticale della linea principale di scarico verso l&#39;altro lato del rack fROM la linea di alimentazione principale. Utilizzare un tubo da 2 &quot;in PVC per questa linea verticale per ricevere la linea di alimentazione principale delle linee migliori e scarico delle vasche dei pesci provenienti da ogni scaffale. </li><li> Tagliare i pezzi di 2 &quot;tubo di PVC per la linea di scarico principale verticale e utilizzare 2&quot; tee PVC per ricevere le linee di scarico del serbatoio di pesce provenienti da ogni scaffale. Terminare la linea principale di scarico nel serbatoio stock di espellere l&#39;acqua riciclata su filtro di spugna. </li><li> Tagliare una apertura per l&#39;intera lunghezza delle 2 &quot;pezzi di tubo in PVC un pollice e allegare alla linea verticale di scarico principale con PVC tees per le linee di scarico orizzontali dalle vasche dei pesci. </li><li> Tappare le &quot;linee di scarico orizzontali con 2&quot; 2 cap PVC. </li><li> Prime e cementare i pezzi con gli accessori necessari (connettori, capezzoli o gomiti). </li></ol> 6. Costruire le vasche dei pesci (Figura 3). <ol><li> Con il trapano, tagliare un &quot;foro posteriore del serbatoio di pesce 1&quot; 1 1/8 sotto il bordo superiore con una sega a tazza. </li><li&gt; Infilare un ¾ &quot;adattatore maschio filettato PVC (con # 18 O anello attaccato) attraverso il foro (dall&#39;interno della vasca verso l&#39;esterno). </li><li> Applicare e stringere a 90 gradi 3/4 &#39;filettato gomito PVC all&#39;adattatore maschio per creare il tubo di scarico serbatoio di pesce. Aggiungere un pezzo di maglia fine prima di avvitare il dado di partecipazione per evitare zebrafish passare attraverso il sistema di scarico. </li><li> Posizionare il serbatoio di pesce con la sua fine tubo di scarico nello spazio aperto della linea di drenaggio dietro i carri armati </li></ol> 7. Avvio del sistema idrico <ol><li> In più contenitori, come quello utilizzato per il serbatoio, misurare tre volte la quantità di acqua contenuta all&#39;interno del sistema. Lasciare riposare l&#39;acqua a temperatura ambiente per condizionamento per 48 h. </li><li> Aggiungere acqua al sistema e lasciare circolare per un minimo di 3 giorni. <ol><li> Cambiare l&#39;acqua nel sistema vigorosamente durante i primi 3 giorni di circolazione al fine di liberare il sistema di contaminanti that risiedono all&#39;interno dei tubi. </li></ol></li><li> Aggiungere zebrafish avviamento e consentire al ciclo dell&#39;azoto per ottenere stabilito. Normalizzare il pH di un coerente 7. Tenere sette zebrafish per 1.8 L, e dar loro da mangiare due volte al giorno durante la settimana e una volta al giorno durante i fine settimana, come suggerito da LiNbO 4 e 6 McNabb. </li><li> Monitorare il nitrato (&lt;75 mg / l), nitriti (&lt;10 mg / l), e di ammonio (0 mg / L) al giorno durante la prima settimana dopo l&#39;aggiunta di pesce, e livelli di due volte a settimana, una volta desiderati sono stati mantenuti con cambi d&#39;acqua regolari . </li></ol>

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	<li>Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A.. , (2010).</li><li>Grim, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogen+(hemgn),+a+transcription+factor+that+regulates+erythropoiesis+and+skeletogenesis+in+zebrafish.">Hemogen (hemgn), a transcription factor that regulates erythropoiesis and skeletogenesis in zebrafish.</a> , (2013).</li><li>Kim, S., Carlson, R., Zafreen, L., Rajpurohit, S. K., Jagadeeswaran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+easy-to-assemble,+low-cost+facility.">Modular, easy-to-assemble, low-cost facility.</a> Zebrafish. 6 (3), 269-274 (2009).</li><li>Linbo, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+(Danio+rerio)+husbandry+and+colony+maintenance+at+the+Northwest+Fisheries+Science+Center.">Zebrafish (Danio rerio) husbandry and colony maintenance at the Northwest Fisheries Science Center.</a> U.S. Dept. Commer., NOAA Tech. Memo. 62, (2009).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. 69, 4196 (2012).</li><li>McNabb, A., Scott, K., Ochsenstein, E., Seufert, K., Carl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Don't+be+afraid+to+set+up+your+fish+facility.">Don't be afraid to set up your fish facility.</a> Zebrafish. 9 (3), 120-125 (2012).</li><li>Garcia, R. L., Sanders, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+cleaning+and+disinfection+procedures+in+a+zebrafish+rerio)+facility.">Efficacy of cleaning and disinfection procedures in a zebrafish rerio) facility.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (6), 895-900 (2011).</li><li>Rivas-Boyero, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+a+nociceptin+receptor+from+zebrafish+(Danio+rerio).">Pharmacological characterization of a nociceptin receptor from zebrafish (Danio rerio).</a> J Mol Endocrinol. 46 (2), 111-123 (2011).</li><li>Sanchez-Simon, F. M., Zhang, X. X., Loh, H. H., Law, P. Y., Rodriguez, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+regulates+dopaminergic+neuron+differentiation+via+miR-133b.">Morphine regulates dopaminergic neuron differentiation via miR-133b.</a> Mol Pharmacol. 78 (5), 935-942 (2010).</li><li>Velasco, E. M., Law, P. Y., Rodr&#237;guez, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mu+opioid+from+the+zebrafish+exhibits+functional+characteristics+as+those+of+mammalian+mu+opioid+receptor.">Mu opioid from the zebrafish exhibits functional characteristics as those of mammalian mu opioid receptor.</a> Zebrafish. 6 (3), 259-268 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse per questo lavoro.

Lo scopo principale di questo articolo è quello di dimostrare che la costruzione di un impianto di zebrafish funzionale non è complicato e può essere costruito da ricercatori di pesce alle prime armi con il minimo della conoscenza costruzione. Inoltre, questo articolo dimostra che i materiali di questo strumento zebrafish funzionale possono essere acquistate facilmente e conveniente nei negozi di animali da compagnia locali o negozi di ferramenta. Una volta che tutti i materiali e gli strumenti sono stati acquisiti l...

In vivo modelli sono essenziali nel condurre ricerca biomedica completa poiché permettono nella ricerca vitro da tradurre a livello di sistema e organismal. Ad esempio, la ricerca con piccoli mammiferi, ovvero roditori, è stato dimostrato necessario lo sviluppo di farmaci e nel miglioramento di farmaci disponibili. Tuttavia, la complessità (finanziariamente e logisticamente) potrebbe rendere praticamente impossibile costruire e mantenere strutture di roditori per la sperimentazione si propone in ricerca di piccole istituzioni accademiche. Tuttavia, in vivo ricerca può essere eseguita utilizzando altre specie animali che richiedono meno elaborati logistica. Zebrafish (Danio rerio) sono stati utilizzati con successo come un modello in vivo per studiare la genetica, lo sviluppo, fisiopatologia e farmacologia 1,2,10,11,12. Le strutture necessarie per ospitare zebrafish per la sperimentazione sono relativamente semplici e molto meno costoso rispetto a rstrutture Odent. Kim et al. 3 hanno recentemente descritto in dettaglio un sistema di alloggiamento zebrafish 80 serbatoio che può essere costruito per circa 1.500 dollari, che include entrambe le parti e il costo del lavoro. Ciò è in netto contrasto con la quasi 8.500 dollari che sarebbe necessario per l&#39;acquisto di un sistema di 80 tank ready-made da qualsiasi numero di fornitori commerciali. Tuttavia, la descrizione data da Kim et al. può essere complicato e difficile da seguire per i novizi di ricerca di pesce. Noi crediamo che un impianto zebrafish può essere costruito in maniera semplificata per un investimento di 1.500 dollari. La creazione di una struttura in vivo alle piccole istituzioni accademiche fornisce loro facoltà un ulteriore strumento con cui produrre ricerca più potente e completa. I dati in vitro supportati da in vivo risultati generalmente produrre ricerca biomedica più completo rispetto ai dati ottenuti utilizzando solo metodi in vitro. Pertanto, larealizzazione di un centro di ricerca in vivo migliorerà in modo significativo il successo dell&#39;istituzione nei suoi sforzi globali di ricerca (esposizione studente alla ricerca, pubblicazioni, comunicazioni, ricerca di finanziamenti esterni, ecc.). La costruzione di un impianto di Zebrafish come quella descritta in questo studio è l&#39;ideale per la ricerca istituzioni accademiche con servizi limitati (o istituzioni senza in vivo strutture di ricerca) durante costrizione financial times.

<table><tbody><tr><td>Item</td><td>Brand</td><td>Quantity</td><td></td></tr><tr><td>74-in H x 48-in W x 18-in D 5-shelf Steel Freestanding Shelving Unit</td><td>Style Selections</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>18-Gallon General Bucket/Tote</td><td>Centrex Plastics: LLC&amp;nbsp;Rugged Tote</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>6-Outlet Power Strip With 15-Ft. Cord</td><td>Master Electrician</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>9-Watt UV Water Garden Clarifier FiIter and UV lamp</td><td>Smartpond&amp;nbsp;</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Whole House Water Replacement Filter</td><td>Whirlpool</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Opaque Whole-House Pre-Filtration Housing</td><td>Whirlpool</td><td>2</td><td></td></tr><tr><td>Thread Seal Tape</td><td>William H Harvey</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>8-fl oz LO-VOC PVC Cement</td><td>Oatey&amp;nbsp;</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>8-fl oz LO-VOC Primer</td><td>Oatey&amp;nbsp;</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>1/4-in x 100-ft Vinyl Drip Irrigation Distribution Tubing</td><td>Mister Landscaper&amp;nbsp;</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>1/4-in Barbed Drip Irrigation On/Off Valve</td><td>Mister Landscaper</td><td>33</td><td></td></tr><tr><td>9-Port NPT Irrigation Manifold with Filter</td><td>&amp;nbsp;Mister Landscaper</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Drop-In Filter with House&amp;nbsp;</td><td>Whirlpool</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>2-in Dia 90-Degree PVC Elbow</td><td>LASCO</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>2-in Dia 90-Degree Tee</td><td>LASCO</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in Dia 90-Degree Slip Elbow</td><td>LASCO</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in Dia PVC Adapter</td><td>LASCO</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in Dia PVC Tee</td><td>LASCO</td><td>12</td><td></td></tr><tr><td>2-in Dia PVC Cap</td><td>LASCO</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>1-in Dia x 3/4-in Dia PVC Adapter</td><td>LASCO</td><td>2</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in PVC Socket In-Line Ball Valve</td><td>American Valve</td><td>5</td><td></td></tr><tr><td>1/2-in Dia x 3/4-in Dia PVC Adapter</td><td>Lasco</td><td>8</td><td></td></tr><tr><td>3/4-in Dia PVC Cap</td><td>Lasco</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>2-In x 5-Ft Pvc Pipe</td><td>Charlotte Pipe</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac34;-In x 10-Ft Pvc pipe</td><td>Charlotte Pipe</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>11/16x1-7/80 PVC ring</td><td>SXT</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; PVC male adapter</td><td>SXT</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac34;&amp;rdquo; PVC coupling&amp;nbsp;</td><td>SXT</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; PVC female adapter&amp;nbsp;</td><td>SXT</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>link</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.8 L Dual Beta Keeper</td><td>Top Fin</td><td>27</td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac34;&amp;rdquo; PVC male adapter (w/ #18 O-ring)</td><td>SXT</td><td>28</td><td></td></tr><tr><td>90-degree &amp;frac34;&amp;rdquo; threaded PVC elbow</td><td>SXT</td><td>27</td><td></td></tr><tr><td>Fine Mesh</td><td>N/A</td><td>1 yard</td><td></td></tr><tr><td>Bulkhead Connector</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Hacksaw</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Hole saw</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable Wrench</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Pliers&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Tape Measure</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Safety Glasses</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr><tr><td>Work Gloves</td><td>N/A</td><td>1</td><td></td></tr></tbody></table>

construction of an affordable and easy-to-build zebrafish facility

In vivo la ricerca biomedica è fondamentale per tradurre in risultati in vitro in progressi clinici. Piccole istituzioni accademiche con risorse limitate trovano praticamente impossibile costruire e mantenere strutture tipiche di roditori per la ricerca. Ricerca Zebrafish ha dimostrato di essere una valida alternativa per la ricerca in vivo in farmacologia, fisiologia, sviluppo e studi genetici. Questo articolo dimostra che un impianto di zebrafish funzionale può essere costruito in modo facile e conveniente. Abbiamo dimostrato che un tale impianto potrebbe essere costruito in circa un giorno di lavoro con gli strumenti minimi e competenze. Il costo del serbatoio di pesce facility zebrafish 27 1.8 L costruito in questo studio è stato di circa $ 1.500. Stimiamo che il mantenimento di un primo lavoro di 150 colonie di pesci per 3 mesi è di $ 1.000. Il progetto ha coinvolto gli studenti, che sono stati introdotti per aquaculturing di zebrafish per la ricerca propone.

La costruzione del sistema di pompa e fltri Una volta che il rack è assemblato e configurato il primo passo è quello di costruire il sistema di pompa e filtro. I filtri sono collegati al sistema di pompa e si trovano al di sopra del livello inferiore del primo ripiano, che consente una facile manutenzione e sostituzione del filtro. Analogamente, la lampada UV è collegato con il tubo di PVC al filtro e tenuto in posizione con fascette di plastica per permettere una facile sostituzione della lampada UV ...

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Construction of an Affordable and Easy-to-Build Zebrafish Facility

A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

Costruzione di una build di facile strumento Zebrafish Affordable e

In vivo biomedical research is pivotal to translate in vitro findings into clinical advances. Small academic institutions with limited resources find it ...

construction-of-an-affordable-and-easy-to-build-zebrafish-facility

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Views.  Presbyterian College School of Pharmacy. A Zebrafish facility suitable for breeding and in vivo research is built in an easy and affordable manner. Maintenance is minimal. This facility is ideal for student involvement and independent research.

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A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Ricerca

Ambiente

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Biologia dello sviluppo

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizzati high-throughput analisi comportamentali nelle larve Zebrafish

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neuroscienze

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Studiare lo sviluppo con la manipolazione della segnalazione optogenetica nel pesce zebra

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Autore in primo piano: Manipolazione della segnalazione negli embrioni di zebrafish per decodificare le decisioni sul destino cellulare 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Attivazione della segnalazione optogenetica negli embrioni di zebrafish

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Cura e manutenzione periodiche di Zebrafish (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratorio: Introduzione

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Biologia

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

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