This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Preparazione di Parasite colture cellulari, Collezione di Parasite Pellet <ol><li> Preparare supporti RPMI-1640-HEPES aggiungendo 10 g di polvere RPMI-1640, 66 mg di solfato di gentamicina, 2 g di bicarbonato di sodio, 5,9 g tampone HEPES, 50 mg ipoxantina e 3,8 g di destrosio in 1 L dH sterile 2 O. Miscelare con tavolo agitatore magnetico fino a quando tutte le dissolve polvere in 1 l di acqua distillata. Eseguire micro filtrazione di media utilizzando 0,22 micron filtro. Conservare il supporto in bottiglie sterili. </li><li> Lavare non infetti (fresco) di tipo A + eritrociti utilizzando RPMI. Preparare il 5% di ematocrito di eritrociti (0,5 ml di eritrociti freschi lavati in 9,5 ml al 10% RPMI siero umano +). </li><li> Fai siero 15% umano + RPMI (15 ml di siero umano e 85 ml di RPMI) per avviare la coltivazione di parassiti. Crea siero umano 10% e RPMI (10 ml di siero umano e 90 ml di RPMI) per continuare coltura di parassiti nei globuli rossi. </li><li> Cultura P. falciparum (3D7 e FCR-3 ceppi) in tipoA + eritrociti umani a 5% ematocrito e il 20% parassitemia in capsula di Petri o un pallone da 75 centimetri a 3 cultura. Mantenere coltura in vitro secondo il metodo di Trager e Jensen candela vaso 26. In alternativa, mantengono culture sono in incubatore a 37 ° C mantenendo 9,5% di CO 2 e 3,4% N 2 gas. Cultura P. falciparum in RPMI 1640 HEPES multimediale integrato con siero umano 10%. </li><li> Sincronizzare P. falciparum cultura aggiungendo 65% Percoll (65 ml di Percoll + 35 ml di RPMI-1640 senza siero umano) alla coltura concentrato 27. </li><li> Centrifugare il concentrato di cultura con Percoll a 2500 xg per 5 minuti che si traduce in 3 strati. Con attenzione, utilizzando una pipetta di trasferimento isolare schizonti dal mezzo di trasferimento in un tubo livello separato in condizioni asettiche 27. </li><li> Lavare le culture isolate con siero umano 10% + RPMI-1640 due volte per rimuovere l&#39;eccesso di Percoll per centrifugazione a 7500 xg per 5 min. Discard il surnatante ogni volta in condizioni asettiche 27. </li><li> Continuare coltura P. sincronizzato schizonti falciparum nel siero umano 10% + RPMI-1640 27. </li><li> Raccogliere schizonti trattando Plasmodium eritrociti -infected con 10 mM Tris pH 8.8 e centrifugazione a 15000 xg per 15 minuti 23. Pellets Conservare parassita a -70 ° C dopo l&#39;aggiunta di 5 ml di inibitore della proteasi (aprotinina) al pellet. Utilizzare pellet parassita per l&#39;estrazione di proteine, isolamento DNA genomico e l&#39;isolamento di RNA. </li></ol> 2. Preparazione plasmide vettore <ol><li> Isolare DNA genomico da P. pellets schizonte falciparum preparate da colture di circa il 20% parassitemia. </li><li> Aggiungere 600 ml di 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS e 1 mg / ml proteinasi K, in pellets in una provetta, omogeneizzare pellet usando una siringa da 1 ml collegata ad un ago 26 G. Alternate riempire la siringacon la miscela pellet e svuotamento in una provetta 20 volte. Incubare provetta contenente omogeneizzato O / N in un bagno a 50 ° C Acque. </li><li> Eseguire fenolo - cloroformio (P + C) estrazione aggiungendo 600 ml di P + C (300 ml di fenolo e 300 ml di cloroformio) a pellet omogeneizzato. Tubo tappo e agitare la miscela vigorosamente invertendo end-to-end del tubo. Provetta da centrifuga a 14000 xg per 2 minuti e raccogliere soluzione acquosa superiore utilizzando una micropipetta in una nuova provetta. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Aggiungere 600 ml di cloroformio per lo strato acquoso nel nuovo tubo dal punto 2.1.2. Agitare la provetta per 10 sec e centrifugare a 14.000 xg per 2 min. Misurare la fase acquosa superiore con una micropipetta e trasferirlo ad una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 0,1 vol 5 M di sodio acetato pH 5,5 e 1 vol di isopropanolo (se strato acquoso è 300 ml aggiungere 30 ml di 5 M di sodio acetato pH 5.5 + 330 ml di isopropanolo) per laici acquosaer dal punto 2.1.3. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Centrifugare la provetta a 14000 xg per 10 minuti per precipitare pellet di DNA. Eliminare il supernatante e lavare pellet con 100 ml di etanolo al 70% (70 ml di etanolo e 30 ml di dH 2 O) per eliminare il sale in eccesso dal DNA. Conservare il DNA in 50 ml di dH 2 O a -20 ° C. </li><li> Progettare avanti e indietro primer utilizzando il software o manualmente per l&#39;amplificazione di P. geni falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 e PF3D7_0114100 precedentemente identificati in studi proteoma 16,18 con opportuni siti di restrizione per permettere la clonazione delle sequenze geniche nelle più siti di clonazione di espressione plasmide pT7CFE1-Chis, come illustrato nella tabella 2. </li><li> Fare un 50 microlitri miscela di reazione con l&#39;aggiunta; 5 ml di isolato P. falciparum DNA genomico, 5 ml di 10x tampone, 5μl di MgCl 2, 1,5 ml di primer forward, 1,5 microlitri diprimer reverse, 0,5 ml di DNA polimerasi T7 e 31,5 ml di dH 2 O e effettuare la reazione a catena della polimerasi (PCR) a 94 ° C per 8 min per denaturazione, 50 ° C per 1 minuto e 30 secondi per l&#39;estensione e 72 ° C per 9 min per la ricottura e rinaturazione per amplificare i geni mostrati nella Tabella 1. </li><li> I prodotti di PCR separate sulle 1% gel di agarosio (1 g di agarosio e 100 ml di acetato di Tris EDTA (TAE) buffer) 32. </li><li> Tagliare le bande di DNA PCR amplificati dal gel di agarosio, disporre le fette di gel contenenti DNA in una colonna di estrazione centrifuga DNA gel e congelare a -20 ° C per 5 min. Aggiungere 100 ml di isopropanolo per le fette di gel ghiacciato e centrifugare a 14.000 xg per 5 min. </li><li> Misurare il flusso continuo acquosa filtrato nel tubo di raccolta dal punto 2.5, usando una micropipetta e trasferire in una nuova provetta. Aggiungere 0,1 vol 5 M di acetato di sodio e centrifugare a 14.000 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e aggiungere 10 ml di dH 2 O a the pellet di DNA. </li><li> Digerire il vettore di espressione pT7CFE1-Chis e frammenti di DNA purificato (da 2,6) in due tubi separati con l&#39;aggiunta di 3 ml di plasmide e 5 ml di prodotti genici PCR per ogni tubo. Aggiungere a ogni provetta, 1 ml di specifici enzimi di restrizione, 2 ml di tampone di reazione e 14 ml di dH 2 O. </li><li> Aggiungere 3 ml di plasmide digerito, 5 ml di frammenti di DNA digerito, 2 ml di 10x tampone ligasi, 1 ml di ligasi e 9 ml di dH 2 O in una provetta. Incubare a 12 ° CO / N. </li><li> Aggiungere 0,1 vol di 3 M acetato di sodio, con pH 5,5 e 2 volumi di etanolo (se il volume di tubi legatura è di 20 ml aggiungono 2 ml di acetato di 3 M di sodio + 44 ml di etanolo) per il tubo dal punto 2.14. Mescolare bene e incubare a -20 ° C per 15 min. </li><li> Centrifugare la provetta a 14000 xg per 15 min. Rimuovere con attenzione il surnatante con una micro pipetta senza disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 100 ml di etanolo al 70% to il pellet dal punto 2.10. Centrifugare la provetta a 14000 xg per 5 min. Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 10 ml di acqua priva di nucleasi per il pellet di DNA. </li></ol> 3. Proteina espressione utilizzando in vitro Cellula umana Free Expression Sistema <ol><li> Preparare 20 ml di miscela di trascrizione misurando 2 ml di pT7CFE1-Chis plasmide DNA ricombinante, 4 ml di tampone 5x trascrizione, 4 ml di mix NTP, 2 ml di T7 RNA polimerasi e 8 ml di acqua priva di nucleasi per 2-step umana in vitro espressione della proteina utilizzando i modelli di DNA. Mescolare componenti in una provetta e incubare per 75 min a 30 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Take 2 microlitri della miscela trascrizione e aggiungerlo a 23 ul di miscela di traduzione contenente 12,5 ml di lisato cellulare HeLa, 2,5 ml di proteine ​​accessorie, 1 ml di soluzione salina A, 0,5 ml di aminoacidi -met, 0,5 ml di aminoacidi -Leu, 181; l di inibitore RNAse, 1,25 ml di mix energetico e 3,75 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Incubare la miscela traduzione da passo 3,2 a 30 ° C per 90 min. Conservare i prodotti tradotti a -20 ° C. </li><li> Preparare 25 ml di trascrizione e traduzione miscela con l&#39;aggiunta di 3 ml di pT7CFE1-Chis plasmide DNA ricombinante, 2 ml di acqua priva di nucleasi, 5 ml di mix di reazione, 12,5 ml di HeLa lisato e 2,5 ml di proteine ​​accessorie per 1-step Umana Accoppiato Expression IVT proteine ​​per i modelli di DNA. </li><li> Incubare la miscela di reazione proveniente dal passaggio 3.4 per 90 min per 6 ore a 30 ° C. Conservare i prodotti di traduzione a -20 ° C. </li></ol> 4. Purificazione di proteine ​​ricombinanti Espressi <ol><li> Aggiungere 75 ml di tampone purificazione 1x a 25 ml di prodotto di traduzione di fare 100 ml di miscela di purificazione. </li><li> Aggiungere 100 ml di resina nichel chelante a 100 ml di mixt depurazioneUre. Wash Ni-resina per due volte con l&#39;aggiunta di 300 ml di dH 2 O e 300 ml di buffer di legame. Risospendere resina e centrifugare a 14000 g per 1 minuto per rimuovere l&#39;eccesso di etanolo. </li><li> Aggiungere 100 ml di miscela di purificazione dal punto 4,2-100 ml di nichel resina chelante e incubare la miscela per 60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare la miscela a 14000 g per 1 minuto e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo etichettato come &quot;flusso attraverso&quot;. </li><li> Resina Lavare con 100 ml di tampone di lavaggio 1x (imidazolo 20 mm, 250 mm NaH 2 PO 4 a pH 8, 2.5 M NaCl e DH 2 O). Centrifugare a 14000 g per 1 minuto e raccogliere il surnatante in provetta con l&#39;etichetta &quot;lavare&quot;. Ripetere il punto 4.5 due volte. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione 1x (imidazolo 100 mM, 250 mM Na 2 PO 4 a pH 8,0, 2,5 M NaCl e dH 2 O) alla resina e incubare per 15 min. Centrifugare a 14000 g per 1 min. Fare il passo eluizione due volte. Ognitempo di raccogliere il surnatante in provette da microcentrifuga fresche e etichetta come &quot;eluito&quot;. </li><li> Dopo l&#39;eluizione, lavare resina due volte come descritto al punto 4.5. Conservare il flusso attraverso, lava e campioni di eluizione a -20 ° C o inferiore. Resina deve essere conservato a 4 ° C. Utilizzare 30 ml di ogni campione per SDS-PAGE e immunoblotting analisi. </li></ol> 5. Coomassie (Bradford) Protein Assay 34 <ol><li> Preparare le soluzioni di livello di albumina sierica bovina (BSA) con la concentrazione di 20 mg / ml (mescolare 10 ml di BSA (2 mg / ml) e 90 ml di dH 2 O), 40 mg / ml (mescolare 20 ml di BSA (2 mg / ml) e 80 ml ​​di dH 2 O), 60 mg / ml (miscela 30 ml di BSA (2 mg / ml) e 70 ml di dH 2 O), 80 mg / ml (mescolare 40 ml di BSA (2 mg / ml) e 60 ml di dH 2 O), 100 pg / ml (miscela 50 ml di BSA (2 mg / ml) e 50 ml di dH 2 O), 160 mg / ml (mescolare 80 ml ​​di BSA (2 mg / ml) e 20 ml di dH2 O) e 200 pg / ml (100 ml di BSA (2 mg / ml). </li><li> Misura 5 ml di flusso attraverso, lava e campioni di eluato dal punto 4.7. Aggiungere 95 ml di dH 2 O. </li><li> Aggiungere 5 ml di Coomassie blu reattivo alle miscele di passi 5.1 e 5.2. Coprire le provette con parafilm e vortex per 10 sec poi incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica (OD) a lunghezza d&#39;onda di 650 nm per i tubi di proteine ​​dal punto 5.3. Concentrazione Plot vs. lettura OD per determinare le concentrazioni di proteine ​​34. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> Aggiungere 5 ml di estratti schizonte da P. falciparum, 2 ml di Escherichia coli espresso ricombinanti Rhop-3 proteine ​​31, 5 ml di proteine ​​ricombinanti espresse utilizzando 2-step e 1 fase in sistemi in vitro di espressione umana e 10 ml di prodotti proteina purificata con il metodo affinità per separare i tubi. </li&gt; <li> Aggiungere tampone campione elettroforesi contenente mercaptoetanolo ad ogni provetta per un volume finale di 20 microlitri di rendere campioni di proteine ​​solubilizzate. Far bollire i tubi per 2 minuti. </li><li> Caricare campioni di proteine ​​solubilizzate su 10% SDS-PAGE per separare le proteine. </li><li> Trasferire proteine ​​separate da SDS-PAGE gel su carta di nitrocellulosa (NCP) per electrophoresing a 35 mA di corrente per il gel in una camera di western blotting semi-secco per 2 ore. </li><li> Blocco PCN dopo il trasferimento con il 2% senza grassi del latte. </li><li> Incubare bloccato PCN con i seguenti anticorpi policlonali diluiti 1: 100 in 2% di latte per eseguire western blotting; anticorpi di coniglio # 676 21 specifica per P. rhoptries merozoite falciparum, anticorpi murini 20 specifici per P. yoelii e P. berghei rhoptries merozoite, antisieri # 685 specifici per la P. falciparum proteine ​​vacuole parassitoforo, SERA (serina ricca antigene) 22 e gli anticorpi specifici per la Maurer217; s proteina schisi PFMC-2TM 28. </li><li> Incubare PCN anche in 1: 100 diluito normali controlli negativi del mouse e siero di coniglio e la cultura trascorso surnatante (SCS) dalle cellule di mieloma SP2. </li><li> Incubare PCN con anticorpi e di controllo a 4 ° C O / N. </li><li> Lavare PCN 4x con Blot tampone e incubare PCN con specie specifici anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) diluito 1: 1000 in 2% di latte. </li><li> Lavare PCN 4x con tampone Blot. Incubare lavato PCN con la soluzione di sviluppo del colore A + B (Soluzione A: aggiungere 50ml di 1x tampone Blot e 30 ml di H 2 O 2; Soluzione B: aggiungere 10 ml di metanolo e 30 mg di 3-cloro-naftolo) per 30 min nel buio. Analizzare i risultati Western Blot colorimetricamente. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

I passi per una proficua espressione di proteine ​​utilizzando due fasi in vitro sistema libera espressione delle cellule umane e di purificazione sono: 1) l&#39;amplificazione di successo e clonazione di geni nelle pT7CFE-Chis plasmide vettore; 2) la trascrizione di RNA a 30 ° C; 3) definizione di proteina a 30 ° C in presenza di inibitore RNAse; 4) lo sviluppo del protocollo di purificazione di affinità based utilizzando perle di resina rivestiti con Ni e 5) analizzare i risultati in Western Blot uti...

Nella ricerca la malaria, l&#39;espressione delle proteine ​​immunogeniche utilizzano sistemi basati cellula procariote o eucariote rimane una sfida. La ricchezza AT del genoma Plasmodium e sconosciute meccanismi posta traslazionali 14,7, contribuiscono alle difficoltà connesse con l&#39;ottenimento di proteine ​​correttamente giunte e immunogenico per gli studi di produzione di anticorpi e vaccini. Sistemi procariotici quali Escherichia coli sono stati utilizzati per l&#39;espressione della proteina ricombinante. Sistemi procariotiche sono a basso costo, efficace, producono alte rese di proteina ricombinante e hanno più vettori di clonazione. Host E. coli sono facili da trasformare e cellule crescono rapidamente. Tuttavia, i sistemi procarioti hanno delle limitazioni come la mancanza di sostituzione aminoacidica, modificazione post-traslazionale, rischio di contaminazione, prodotti eterogenei e l&#39;accumulo di proteine ​​ricombinanti in corpi di inclusione 24. In unstudio di Mehlin et al. (2006), sono stati espressi 1000 fotogrammi di lettura aperta (ORF). Circa il 7% delle proteine ​​espresse erano solubile 14. L&#39;insolubilità osservata è dovuta alla natura di parte dei geni e l&#39;alta frequenza di codoni che sono idealmente utilizzato dal Plasmodium AT ricca genoma 14. Una strategia alternativa per superare questo problema è stato sviluppato usando plasmidi o cellule ospiti contenenti tRNA che riconoscono codoni rare o codoni che corrispondono alle frequenze 3. Anche dopo l&#39;esecuzione di queste ottimizzazioni, molto piccole porzioni di proteine ​​sono espresse come solubili, attiva e immunogenico 14. I sistemi di espressione cell-free contengono tutti i componenti necessari per la trascrizione e la traduzione, come ribosomi, fattori di inizio, fattori di allungamento (fattori traduzioni), tRNA e aminoacil-tRNA sintetasi. Entrambe le reazioni di trascrizione e traduzione sono accoppiati in procedimento a passo 11,29. Il transcrireazione ption viene eseguita in un tubo prima quantità appropriata di mRNA viene incubato con macchinari traduzione in un&#39;altra 11,29 tubo. Sebbene questi metodi sono efficaci nel Plasmodium sp. Espressione della proteina, un grave inconveniente è la lunghezza di tempo per l&#39;espressione della proteina, che è di circa 22 ore 29. Inoltre, l&#39;alto costo delle forniture per l&#39;inclusione nei protocolli 29, i preparativi alta intensità di lavoro del lisato cellulare e incongruenze nelle preparazioni dei componenti, rendono questi sistemi irraggiungibile. L&#39;obiettivo principale dei ricercatori per lo sviluppo di un sistema di libera espressione delle cellule dipende da fattori come la modificazione genetica rapida, rese veloci con alte concentrazioni e diritte preparati lisato avanti 1. Sistemi eucarioti come il lievito, linee cellulari di mammiferi, baculovirus sistema di espressione mediata, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum e sistemi di espressione parassitarie such come Leishmania sono stati utilizzati per l&#39;espressione della proteina ricombinante 7. Sistemi eucarioti condividono relazione filogenetica e quindi condividono anche caratteristiche come la glicosilazione, acilazione, formazione di legami disolfuro, interazione chaperone, proteolisi e compartimentalizzazione sub-cellulare. Proteine ​​eventi secrezione in eucarioti prevengono l&#39;accumulo e diminuisce la tossicità per sistemi di espressione 13. L&#39;uso di sistemi di lievito è preferito come sono adatti per l&#39;espressione di proteine ​​in larga scala e per ottenere alte rese 4. Due P. falciparum proteine ​​PFCP-29 e Pvs25 sono state prodotte utilizzando il sistema di lievito 4. Tuttavia, un grave inconveniente nella sintesi della maggior parte delle proteine ​​era N e O-glicosilazione pattern irregolari, pieghevole improprio e troncamento di proteine ​​dalla loro forma nativa 4. L&#39;uso di cellule di mammifero per la sintesi delle proteine ​​ricombinanti è laboriosa ed è expenSIVE di mantenere stabili linee cellulari ricombinanti 4. Pertanto, le cellule di mammifero sono stati limitati per l&#39;analisi di proteine ​​di segnalazione, interazioni proteina e interazioni parassita-ospite e anche per testare vaccini DNA 4. Il DNA umano e in vitro sistema privo di cellule mRNA in espressione della proteina qui descritto è un sistema basato su mammiferi HeLa derivato dalle cellule che esprime proteine ​​in 3 ore. Proteine ​​espresse utilizzando pT7CFE1-Chis vettore di espressione hanno un tag C-terminale facilitare l&#39;identificazione e la purificazione. Il sistema basato HeLa è completato con i fattori di inizio della traduzione e un regolatore di traduzione, migliorando così l&#39;efficienza del sistema di traduzione. Le proteine ​​possono essere rapidamente tradotti, vagliati, verificati ed elaborati per l&#39;utilizzo in diverse applicazioni immunologici e strutturali 15. Sistemi di espressione senza cellule eucariotiche come germe di grano e reticolociti di coniglio sono attualmente utilizzati per l&#39;espressione di varproteine ​​eucariotiche ious compreso Plasmodium proteine ​​11,29. Inoltre, E. sistemi acellulari basate coli sono anche impiegati per l&#39;espressione della proteina eucariotica 11. Tabella 1 riassume diversi sistemi di espressione di cellule libera confrontando caratteristiche dei sistemi, nonché la facilità di utilizzo dei sistemi per l&#39;espressione della proteina. Il sistema privo di cellule umane in confronto agli altri ha la capacità di eseguire postali e co-traslazionale modificazioni ed è meno costoso. Ottimizzazione Codon è possibile e tutte le reazioni possono essere eseguite in 3 ore. Il sistema HeLa è un sistema di traduzione ideale per la sintesi proteica in ambiente di laboratorio. Uno dei principali vantaggi di sistemi di espressione di cellule umane libera rispetto ad altri sistemi cell free è la disponibilità di diverse linee cellulari derivate da diversi diversi organi e tessuti. Diverse varietà di sistemi liberi di cellule possono essere progettati in funzione della linea cellulare. L&#39;estrattos derivate dalle cellule dei mammiferi hanno una maggiore efficienza di sintetizzare proteine ​​di grandi dimensioni di tutti gli altri sistemi di espressione delle cellule gratuito. Questi sistemi cella libera espressione possono essere utilizzate anche in applicazioni diagnostiche e caratterizzazione di proteine ​​come microarray 30. Le linee popolari cellule HeLa sono più ampiamente utilizzati per effettuare l&#39;espressione di proteine ​​33. Il reticolo endoplasmatico in linee cellulari HeLa è sottosviluppati, portando alla mancanza di attività di modifica glicosilazione post-traduzionale 33. Tuttavia, questo sistema è ritenuto vantaggioso per Plasmodium sintesi proteica come Plasmodium manca anche traduzione modifica glicosilazione alberino 29. La libera protocollo di trascrizione-traduzione cellule HeLa è facile da eseguire, poco costoso e proteine ​​può essere espresso in 90 min, pronta per la purificazione e altre applicazioni a valle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

La malaria causa una significativa morbilità e mortalità globale. Nessun vaccino di routine è attualmente disponibile. Uno dei motivi principali per la mancanza di un vaccino è la sfida di identificare idonei vaccini candidati. Proteine ​​malariche espressi utilizzando sistemi di espressione cellulari basati procariote ed eucariote sono scarsamente glicosilate, generalmente insolubile e sottoposti pieghevole improprio con conseguente riduzione della immunogenicità. I sistemi di espressione libere di germe di grano, reticolociti di coniglio lisato ed Escherichia coli lisato sono attualmente utilizzati per l&#39;espressione di proteine ​​della malaria. Tuttavia, la lunghezza del tempo di espressione e glicosilazione impropria di proteine ​​rimane ancora una sfida. Dimostriamo espressione di proteine ​​Plasmodium in vitro utilizzando sistemi di espressione libera cellulari basato HeLa, denominati &quot;sistemi in vitro di cellule umane libera espressione&quot;. I sistemi di espressione cell free basato 2 HeLa trascrivere mRNA in 75 minuti e 3 ml di transcribed mRNA è sufficiente la traduzione proteine ​​in 90 min. Il sistema di espressione 1-passo è una trascrizione e traduzione sistema di espressione accoppiato; la trascrizione e co-traslazione avviene in 3 ore. Il processo può anche essere esteso per 6 ore fornendo energia supplementare. Nel sistema di espressione 2-passo, viene prima mRNA trascritto e quindi aggiunto alla miscela di traduzione per l&#39;espressione della proteina. Descriviamo come esprimere le proteine ​​della malaria; una idrofobica Cleft di PF3D7_0114100 Maurer - 2 transmembrana (PFMC-2TM) di proteine, una proteina PF3D7_0925900 idrofila e un armadillo ripete contenenti proteine ​​PF3D7_1361800, utilizzando il sistema di espressione delle cellule HeLa base. Le proteine ​​sono espresse nelle micro volumi impiegando strategie di espressione 2-step e 1-step. Un metodo di purificazione di affinità per purificare 25 ml di proteine ​​espresse utilizzando il sistema di libera espressione in vitro delle cellule umane è anche descritto. Resa di proteine ​​è determinato mediante saggio di Bradford e l&#39;espressoe proteine ​​purificate possono essere confermati da analisi di western blotting. Proteine ​​ricombinanti espresse possono essere utilizzati per vaccinazioni, test immunologici e proteine ​​sequenziamento.

Validazione delle proteine ​​ricombinanti espresse attraverso la reattività con anticorpi specifici è un primo passo importante nel confermare il corretto ripiegamento delle proteine ​​espresse. Proteine ​​ricombinanti malariche sono state espresse utilizzando un passo e due fasi in sistemi di espressione libero cellulari umane in vitro. Le proteine ​​ricombinanti sono purificati metodo affinità Ni-chelante. Abbiamo poi utilizzato antisieri contro interi rhoptries merozoite in western blotting di SDS-...

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HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Espressione di proteine ​​della malaria nei sistemi basati su celle rimane difficile. Dimostriamo due sistemi di cella di espressione libera di passo e un passo IVT (nella traduzione vitro) per l&#39;espressione di proteine ​​della malaria rhoptry ricombinanti da cellule HeLa. Usiamo un sistema di purificazione a base Ni-resina di affinità per purificare le proteine ​​rhoptry.

Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K Views.  Cleveland State University.  Espressione di proteine ​​della malaria nei sistemi basati su celle rimane difficile. Dimostriamo due sistemi di cella di espressione libera di passo e un passo IVT (nella traduzione vitro) per l'espressione di proteine ​​della malaria rhoptry ricombinanti da cellule HeLa. Usiamo un sistema di purificazione a base Ni-resina di affinità per purificare le proteine ​​rhoptry. 

Video: HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Ricerca

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Valutazione di espressione GFP e sostenibilità Utilizzando la Image-Based Tali Citometro

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolli per l&#39;implementazione di un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...