La nostra scoperta suggerisce che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura di cardiomiociti a cellule endoteliali è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo delle cellule endoteliali nella protezione dei cardiomiociti contro il danno simulato da rifonde di ischemia. I modelli di co-coltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula sulla funzione e la differenziazione cellulare. Tuttavia, trattamenti separati tra tipi di cellule e analisi a valle di un singolo tipo di cellula non sono prontamente fattibili nella co-coltura mista.
L'attuale studio mirava a creare due strati cellulari separati con una distanza significativa tra loro in cui si può indurre lesioni da riprofusione di ipossia e studiare il risultato e gli effetti su un singolo tipo di cellula. Inizia la preparazione scongelando entrambe le linee cellulari. Impiattare le cellule in palloni T25 dopo averle lavate con mezzi freschi.
Il giorno successivo, aggiornare le celle con i supporti e utilizzarle quando confluenti. Mantenere l'incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 21% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica e il 74% di azoto. Tenerlo umidificato.
Stimare la confluenza della linea cellulare dei cardiomiociti al microscopio ottico. Rimuovere il materiale dai palloni contenenti colture cellulari confluenti e tripsinizzare con tre o cinque millilitri di tripsina-EDTA per pallone. Agitare delicatamente il pallone e incubare a 37 gradi Celsius per due o cinque minuti.
Successivamente, valuta i progressi enzimatici al microscopio ottico. Dopo il distacco, inattivare la soluzione di tripsina aggiungendo la trysina o la soluzione cellulare a un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di media per pallone T25. Centrifugare la sospensione cellulare a 120 x g per due minuti per ottenere un pellet a cellule molli.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospese il pellet in cinque millilitri di un mezzo. Quindi, eseguire il conteggio delle cellule e confermare la vitalità delle cellule. Mescolare e aliquotare 10 microlitri di cellule risospese e 10 microlitri di colorante blu di tripano, quindi contare le cellule viventi usando un contatore di cellule.
Diluire le cellule con mezzi regolari freschi per ottenere le densità di semina desiderate. Prendi una piastra a 24 pozzetti pre-rivestirla con matrice extracellulare e cardiomiociti a piastra a densità di semina di 300.000 per pozzetto sul fondo della piastra. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte.
Dopo 24 ore, le cellule endoteliali a piastra in inserti ad una densità di placcatura ottimale di 100.000 per inserto. Dopo 24 ore di placcatura delle cellule endoteliali, posizionare gli inserti delle cellule endoteliali all'interno dei pozzetti dei cardiomiociti e avviare la co-coltura. Consentire alle cellule di co-coltivare per 12-24 ore prima di eseguire gli esperimenti.
Preparare il mezzo ipossico versando circa 25 millilitri di media in un tubo conico da 50 millilitri. Sigillare ad aria la parte superiore con una membrana in silicone e utilizzare una pipetta sterilizzata per praticare un foro. Successivamente, creare un altro foro e lasciare circa 2/3 delle pipette immerse nel supporto.
Lavare il fluido con gas ipossico per cinque minuti a una portata di 30 litri al minuto, quindi scartare il mezzo delle piastre a 24 pozzetti o degli inserti di coltura contenenti cellule attaccate. Lavali molto delicatamente con 100 microlitri del 10% PBS per pozzetto aggiungere 500 microlitri del mezzo ipossico appena preparato a ciascun pozzetto delle piastre o degli inserti. Sostituire il supporto originale con mezzi normali freschi contenenti glucosio e siero nel gruppo di controllo normossico.
Posizionare una capsula di Petri piena di acqua sterile nella camera dell'ipossia per umidificare la camera. Quindi posizionare le piastre contenenti i gruppi ipossici nella camera. Lavare la camera dell'ipossia con gas ipossico per cinque minuti con un flusso di 30 litri al minuto.
Successivamente, posizionare la camera all'interno di un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'ipossia, scartare il vecchio mezzo delle piastre o degli inserti e aggiungere 500 microlitri di mezzi normali contenenti glucosio e siero a ciascuna parete delle piastre, quindi conservare le piastre all'interno di un incubatore in condizioni di coltura normali per due ore per imitare la riperfusione. Trasferire il terreno di coltura cellulare dalla piastra a 24 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, quindi prelevare 200 microlitri di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e distribuiti equamente in quattro pozzetti della piastra a 96 pozzetti.
Misurare l'assorbanza per LDH utilizzando un kit di analisi di citotossicità in una piastra a 96 pozzetti e seguire le istruzioni del produttore per determinare il grado di lesione cellulare. In questo studio sono stati valutati tre tipi di inserti. Tutti e tre gli inserti avevano la stessa dimensione dei pori di 0,4 micrometri.
L'unica differenza tra loro era l'inserto all'altezza di base, consentendo alle distanze tra i due strati cellulari co-coltivati di essere 0,5, 1,0 e 2,0 millimetri. Utilizzando questo protocollo, le cellule sono state coltivate in condizioni normali di ossigeno e poi divise in due gruppi: un gruppo di controllo normossico e il gruppo ipossia. Dopo 24 ore, entrambi i gruppi sono stati rinfrescati con i media e coltivati in condizioni normali di ossigeno per altre due ore prima di condurre i test finali.
Un confronto dei tre tipi di inserti di coltura nella valutazione del rilascio di lattato deidrogenasi per cardiomiociti da soli, cellule endoteliali da sole e co-coltura di cardiomiociti con cellule endoteliali è mostrato qui in condizioni normossiche, solo ipossidiche e di riossigenazione dell'ipossia. Con una distanza di 0,5 millimetri tra gli strati cellulari, l'ipossia ha portato ad un aumento significativo del rilascio di LDH rispetto alla normossia quando i cardiomiociti sono stati coltivati da soli. Tuttavia, l'LDH è aumentato solo leggermente nel gruppo di riossigenazione dell'ipossia rispetto al solo gruppo dell'ipossia.
Quando le cellule endoteliali e i cardiomiociti sono stati co-coltivati insieme, l'aumento del rilascio di LDH nelle sole condizioni di ipossia non è stato attenuato. Ciò indica che le cellule endoteliali non hanno avuto alcun effetto protettivo rispetto al gruppo dei cardiomiociti da soli nelle condizioni di ipossia. Tuttavia, le cellule endoteliali hanno esercitato una protezione lieve ma significativa sui cardiomiociti durante la hr. Quando la distanza tra gli strati cellulari era di un millimetro, il rilascio di LDH era anche significativamente aumentato nei cardiomiociti solo nella condizione di ipossia.
Tuttavia, a differenza dell'inserto da 0,5 millimetri, l'aumento dell'LDH solo nei cardiomiociti è stato potenziato dall'HR rispetto alle sole condizioni di ipossia. Questo aumento è stato ancora più pronunciato con l'inserto di due millimetri. La concentrazione di cellule endoteliali placcate in inserti a due millimetri è stata titolata rispettivamente a 25.000, 50.000 e 100.000 cellule per inserto.
è stato riscontrato che l'aumento dell'intensità delle cellule endoteliali nella co-coltura ha portato ad un'attenuazione dose-dipendente del rilascio di LDH causata da HR. Tuttavia, nessun effetto di questo tipo è stato osservato in condizioni normossiche. Questa metodologia di co-coltura non è limitata alle cellule endoteliali e ai cardiomiociti. Questi metodi dovrebbero aiutare a studiare specifiche interazioni cellula-cellula tra varie linee cellulari attraverso più organi di interesse.
