Questo metodo consente di identificare l'ubiquità della proteina CENP-A taggata dall'EYFP. Può anche essere applicato alla proteina CENP-A umana con diversi test e altre proteine. Il vantaggio principale di questo è che può essere utilizzato per identificare siti onnipresenti EYFP CENP-A K124R con un significato biologico cruciale.
Potrebbe essere esteso per studiare le modifiche post-traslazionali di una vasta gamma di proteine funzionali. Inizia preparando la proteina A perline legate con anticorpi anti-GFP. Lavare 25 microlitri di proteine A per reazione di immunoprecipitazione con tampone A1 almeno tre volte per rimuovere l'etanolo.
Quindi creare una soluzione di perline del 50% con buffer A1. Aggiungere due microlitri di anticorpo anti-GFP alle perline. Quindi aggiungere il buffer da A1 a 20 volte il volume netto delle perline. Eseguire la rotazione end-to-end a quattro gradi Celsius per quattro-18 ore.
La durata ottimale per la rotazione deve essere determinata empiricamente in base all'efficienza dell'immunoprecipitazione. Dopo la rotazione, centrifugare le perline a 100 volte g per un minuto e rimuovere il supernatante non legato. Aggiungere tampone A1 per fare una soluzione al 50% di perline e utilizzare 25 microlitri di questa soluzione per ogni reazione di immunoprecipitazione.
Per eseguire l'immunoprecipitazione, liscire le cellule nel tampone A1 tramite sonicazione e congelare/scongelare. Misurare le concentrazioni proteiche e normalizzare le quantità proteiche tra i diversi campioni IP. Quindi rimuovere il 5% del campione da ogni tubo da eseguire nella pagina SDS.
Mescolare il resto del lysate con 25 microlitri di proteine A perline legate all'anticorpo anti-GFP ed eseguire la rotazione end-to-end a quattro gradi Celsius per quattro-18 ore. Dopo aver lisciviato le cellule nel tampone A ed eseguito l'immunoprecipitazione come descritto in precedenza, mantenere il 10% degli immunoprecipitanti totali per confermare l'ubiquità CENP-A dell'EYFP e determinare con precisione la posizione dell'EYFP CENP-A ubiquitilato. Utilizzare l'altro 90% per l'analisi della spettrometria di massa.
Eseguire il campione di spettrometria di massa in un gel proteico Bis-Tris 4-12%disponibile in commercio. Quindi eseguire la colorazione blu Coomassie e asportare la regione gel da 50-70 kilodalton per l'analisi della spettrometria di massa. Dadi ogni fetta di gel in piccoli pezzi e mettili in un tubo di legame a basso contenuto proteico da 0,5 millilitri.
Lavare i pezzi di gel con 100 microlitridi di acetonitrile al 50% in bicarbonato di ammonio millimolare. Vortice per 10-15 minuti. Quindi spinli verso il basso e scarta il supernatante.
Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare i pezzi di gel con un concentratore sottovuoto da banco per 30 minuti. Aggiungere 10 microlitri di 10 nanogrammi per microlitri che sequenziano la trippsina e lasciare che i pezzi di gel si reidratano per cinque minuti. Quindi aggiungere 25 bicarbonato di ammonio millimolare, quanto basta per coprire i pezzi di gel e digerirli a 37 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, trasferire il supernatante digerito in un tubo siliconato pulito da 0,65 millilitri e aggiungere il 50% di acetonitrile e la soluzione di acido formico al 5%. Vortice il campione per 10 minuti. Quindi giralo verso il basso e trasferisci il supernatante in un tubo di estrazione.
Concentrare nuovamente il campione su due microlitri. Aggiungere quindi otto microlitri di soluzione di acido 3% acetonitrile e 2% formico. Vortice per 15 minuti e girare verso il basso a 16.000 volte g per 30 minuti.
Eseguire l'acquisizione dei dati MS con LC-MS/MS utilizzando un sistema di cromatografia liquida abbinato a uno strumento di spettrometria di massa. Iniettare otto microlitri del campione in una colonna di cromatografia liquida in fase inversa e separare i peptidi con un gradiente del 2-80% del solvente B in 60 minuti dopo le indicazioni manoscritte. Raccogliere dati di spettrometria di massa utilizzando la modalità di acquisizione dipendente dai dati.
Aprire il software commerciale per analizzare i dati della spettrometria di massa sul desktop. Per avviare una nuova ricerca, fare clic sul pulsante LC nel menu in alto. Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi per caricare i file di dati non elaborati MS originali.
Selezionare l'ID proteina umana nel metodo paragon come metodo di ricerca del database e cercare i file di dati raw MS originali nel database UniProt homo sapiens. Selezionare la tripina come enzima di digestione e impostare il resto dei parametri in base alle direzioni del manoscritto. Immettere il nome del file dei risultati e fare clic sul pulsante Salva con nome a destra del menu.
Quindi selezionare una cartella per archiviare i risultati della ricerca e fare clic sul pulsante Salva. Fare clic sul pulsante processo per avviare la ricerca. Al termine della ricerca, i dati con il nome di ricerca immesso verranno memorizzati automaticamente nella cartella selezionata.
Per ottenere gli spettri MS/MS di qualsiasi peptide specifico, aprire i risultati della ricerca nel software F.Quindi fare clic sulla proteina nell'elenco delle proteine nel menu in alto e fare clic sul peptide nel menu centrale. L'MS/MS di questo peptide apparirà nella parte inferiore del menu. Per esportare e salvare gli spettri MS/MS, copiare gli spettri e incollarli in un formato di file adatto.
I costrutti genici di tipo selvatico EYFP CENP-A o mutante K124R che salva la perdita di CENP-A endogeno sono stati espressi stabilmente quando è stata eseguita l'integrazione retrovirale. L'espressione del CENP-A endogeno non è stata rilevata sette giorni dopo l'induzione della ricombinasi di Cre. Sia il tipo selvatico EYFP CENP-A che l'espressione proteica K124R sono risultati ad un livello simile alla proteina CENP-A endogena iniziale.
Sia i mutanti selvatici EYFP CENP-A che K124R hanno mostrato la localizzazione del centromero a sette giorni dall'interruzione della restante espressione del CENP-A endogeno. Il tipo selvaggio EYFP CENP-A e il mutante K124R mostravano ubiquità e interazione con HJURP a differenza della cassa per il tipo selvaggio CENP-A contrassegnato o non registrato e il mutante K124R. La vitalità cellulare è stata valutata eseguendo il test di crescita della colonia 14 giorni dopo l'interruzione del rimanente allele endogeno CENP-A.
Sia i mutanti selvatici EYFP CENP-A che K124R hanno mostrato un numero simile di colonie salvate 14 giorni dopo l'interruzione del restante allele endogeno CENP-A. La spettrometria di massa IP ha rivelato ubiquisizione a lysine 306 in EYFP CENP-A K124R nelle cellule CENP-A meno F. Tutti insieme, questi risultati hanno suggerito che la fusione di proteine di grandi dimensioni induce ubiquisizione in una lisina diversa da K124R nel CENP-A che inibisce il fenotipo mutante singolo K124R originale.
Quando si tenta questo protocollo, utilizzare i gel proteici 4%12%Bis-Tris disponibili in commercio per eseguire i campioni di spettrometria di massa. Aggiungere una tripina adeguata ai pezzi di gel e reidratarli fino a quando tutti gli enzimi non sono stati assorbiti. La tecnica di etichettatura o sondaggio a peso molecolare inferiore è in realtà necessaria per visualizzare l'ubiquitàlazione e indagare la segnalazione di ubiquità della proteina temporale spaziale a livello dell'intero organismo.
