Gli autori desiderano ringraziare il GWU Harlan Fellowship per il supporto di Paaqua Grant e il GWU Luther Rice Fellowship per il supporto di Mona Herold. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation concessione MCB-1121711.

1. Preparazione di terreni di coltura, strumenti e piatti <ol><li> Contrasta con quattro pinze Alumina pellicola abrasiva. Fate questo sotto un microscopio da dissezione per monitorare la grandezza della punta. Una coppia di pinze serve come back-up in caso di una punta è danneggiata durante la procedura. Autoclavare tutte e quattro le pinze e conservare in un contenitore sterile. </li><li> Fai 500 ml ciascuna di terreno di coltura e di 0,1 X. 1.0X (sia di Marc Ringers Modified [MMR] o modifica di Barth Saline [MBS], ricette in 15) e filtro sterilizzare. Noi abitualmente uso MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2.5 mM NaHCO 3). Conservare a 14-18 ° C per mesi. </li><li> Fare una soluzione al 2% di agarosio in mezzo di coltura (2 g elettroforesi agarosio in 100 ml 1X mezzo di coltura in una bottiglia di vetro con tappo a vite). Autoclave per sciogliere agarosio. Questo può essere conservato a 4 ° C per mesi, e scaldati per liquefare il agarosio quando è necessario successivo. </li><li> Mentre l&#39;agarosio è liquido, versare circa 0,5 ml sul fondo di ciascun pozzetto di una sterile 24-pozzetti cultura. Questo impedisce l&#39;espianti di attaccarsi alla plastica. </li><li> Mentre l&#39;agarosio è liquido, versare circa 2-3 ml sul fondo di due o tre piatti di 60 millimetri Petri, e agitare delicatamente per assicurarsi che il fondo è coperto. Questi risultati serviranno come piatti dissezione e l&#39;agarosio embrioni impedisce di attaccarsi alla plastica una volta che le loro membrane vengono rimossi. </li><li> Quando l&#39;agarosio si è raffreddato e indurito, fiamma la punta di un 6 &quot;pipetta Pasteur finché non si scioglie in un pallone, e leggermente toccare la superficie del agarosio in ciascun pozzetto della piastra di coltura. Ciò creerà una depressione poco profonda in cui l&#39;espianto sarà posto. </li><li> Riempire ogni pozzetto della piastra di coltura con terreno di coltura 1X sterile. </li><li> Quando l&#39;agarosio si è raffreddato e indurito, riempire il piatto dissezione con terreno di coltura diluita (0,1 X. MMR o 0.1X MBS) per facilitare la separazione blastomeri. </li&gt; </ol> 2. Selezione degli embrioni <ol><li> Ottenere uova fecondate e rimuovere la gelatina cappotti secondo protocolli standard 15. Trasferirli 0.5X mezzo di coltura in una capsula di Petri 100 millimetri. </li><li> Quando raggiungono embrioni di 2 cellule stadio, ordinare quelli in cui il solco prima segmentazione biseca l&#39;area leggermente pigmentata nell&#39;emisfero animale (Figura 1) in una piastra separata. Questi saranno i donatori per gli espianti. Tenere le restanti 2-cellule di embrioni in un piatto a parte accanto agli embrioni donatori durante l&#39;intera procedura di servire come controlli di pari livello per mettere in scena gli espianti. </li></ol> 3. Preparazione di espianti <ol><li> Posizionare embrioni 5-10 in un piatto dissezione, ma solo lavorare su un embrione alla volta. </li><li> Posizionare il primo embrione così la membrana vitellina trasparente può essere visto, è separato da uno spazio libero (spazio perivitellino) sopra la superficie del polo animale dell&#39;embrione. Utilizzando una forza affilataps in mano sottodominante (mano sinistra se si è di mano destra), afferrare la membrana vitellina sopra lo spazio perivitellino. Utilizzando una pinza affilate con l&#39;altra mano, afferrare la membrana vicino alla prima punta pinze, e tirare delicatamente in direzioni opposte a sbucciare la membrana di distanza. Effettuare la presa iniziale ad una distanza dalla cella che deve essere sezionato, in modo che la cellula bersaglio non sia danneggiata durante la rimozione della membrana. Si può dire che la membrana è stato rimosso perché l&#39;embrione si appiattisce. </li><li> Afferrare una cella confinante con la pinza in mano sottodominante e utilizzare questa cella come &quot;maniglia&quot; così la cella da dissezionare non è direttamente toccata. Con la pinza in altra parte, tirare delicatamente le cellule rimanenti vicine dal blastomero desiderato. Se le cellule della linea mediana, che condividono lo stesso destino, sono mirati, possono essere rimossi insieme come una coppia. Infine, sezionare via la cella &quot;maniglia&quot;. </li><li> Sollevare il blastomero (o coppia di blastomeri), con una sterile, Vetro pipetta Pasteur, evitando bolle d&#39;aria e di aspirazione eccessiva. La pipetta può essere il fuoco lucidato per eliminare spigoli vivi che possono danneggiare la cellula, ma non di routine farlo. Posizionare la punta della pipetta Pasteur sotto la superficie del terreno di coltura in un pozzetto della piastra di coltura espianto, e delicatamente espellere il blastomero. Dovrebbe scivolare nella depressione poco profonda per gravità. Blastomero stesso da più di un embrione possono essere combinati in un unico espianto. </li><li> Ripetere questa procedura con embrioni rimanenti nel piatto dissezione, uno per uno. Dopo circa 10 embrioni, il piatto dissezione sarà riempita di detriti cellulari. In questo caso, passare a un piatto dissezione fresco. </li><li> Dopo che tutte le dissezioni sono fatti, verificare se gli espianti sono nelle depressioni poco profonde. Se non, possono essere delicatamente spinto nella depressione con un&#39;ansa capelli che è stato sterilizzato in etanolo 70% ed essiccato all&#39;aria. </li><li> Circa un&#39;ora dopo l&#39;ultima dissezione, rimuovere i detriti surrounding espianti guarite con una sterile, vetro pipetta Pasteur. </li><li> Cultura il piatto di espianti a 14-20 ° C vicino alla piastra Petri contenente il fratello, gli embrioni di controllo. Embrioni Sibling indica lo stadio di sviluppo degli espianti blastomeri. </li></ol> 4. Espianti raccolta per l&#39;analisi <ol><li> Raccogliere gli espianti quando i fratelli raggiungono la fase di sviluppo desiderato. Questi espianti sopravvivere abbastanza bene anche se alcune delle cellule disintegrarsi. Pertanto, se vi è una massa nuvoloso cultura bene, esplorare con un&#39;ansa capelli o pinze per determinare se un espianto sano è sepolto all&#39;interno. </li><li> Raccogliere espianti in un piccolo volume di soluzione di coltura con una pipetta Pasteur di vetro, e delicatamente espellerli in un tampone di lisi o fissativo appropriato per il saggio sia condotto. </li></ol>

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	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li><li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis.">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li><li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20+Early+events+in+frog+blastomere+fate+determination.">Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination.</a> Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).</li><li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus.">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li><li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways.">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li><li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le fasi più critiche per la coltivazione di successo di singoli blastomeri sono: 1) identificare correttamente il blastomero di interesse; 2) il mantenimento di una sterile, sana cultura; 3) le cellule dissezione presso la parte corretta del ciclo cellulare e 4) a sviluppare la manualità necessaria destrezza per evitare danni durante la dissezione e trasferire alla cultura bene. Per manipolare blastomeri specifici, è essenziale essere in grado di identificare gli assi cardinali. In embrio...

Xenopus laevis embrioni sono stati utilizzati ampiamente per identificare i meccanismi con cui le cellule embrionali acquisiscono i loro destini, poichè le loro uova sono grandi abbastanza da permettere approcci microchirurgiche. Inoltre, si sviluppano esternamente senza la necessità di integrazione nutrizionale del terreno di coltura in quanto ogni cella contiene una ricca intracellulare di piastrine tuorlo che forniscono un negozio intrinseca energia. Un elemento importante per lo studio dei meccanismi attraverso i quali si determina il destino della cellula è la serie completa di mappe destino dei blastomeri fase a scissione (da 2 - a 32 celle stadi) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Queste mappe sono state costruite da una molecola microinjecting rilevabile in un unico, blastomero identificabile e il monitoraggio in seguito allo sviluppo che i tessuti sono popolate dalla progenie etichetta. Mappe destino consistenti sono possibili perché gli assi cardinali degli embrioni possono essere identificati in molti Embryos. In primo luogo, tutti gli embrioni wild type l&#39;emisfero animale è pigmentata, mentre l&#39;emisfero vegetale non lo è. Secondo, l&#39;ingresso dello spermatozoo nella fecondazione provoca una contrazione della pigmentazione animale emisfero verso il lato ventrale futuro, in molti embrioni una differenza pigmentazione pertanto possono essere utilizzati per discriminare i lati dorsale e ventrale. Terzo, il solco prima segmentazione approssima il piano sagittale nella maggior embrioni, e quindi può essere utilizzato per identificare i lati destro e sinistro del embrione. Le mappe destino si basano anche sul fatto che naturalmente fecondato le uova frequentemente aderire nella schemi regolari che rendono ogni blastomero identificabile attraverso una vasta popolazione di embrioni. Mentre non vi è variabilità all&#39;interno e tra le grinfie di uova in materia di modelli di pigmentazione e scissione, con procedure di selezione descritte nel presente documento consente di cellule con destini prescritti da identificare con circa il 90% di accuratezza. Destini cellulari possono essere dissuadereestratto durante l&#39;embriogenesi da diversi meccanismi. I fattori intrinseci, come differenzialmente ereditati mRNA citoplasmatici o proteine, contribuiscono a diversi aspetti di patterning precoce. Ad esempio, specifici mRNA materni determinare le celle contribuirà alla linea germinale, diventare il endoderma, o contribuire all&#39;asse dorsale del corpo (recensione in 7). I fattori estrinseci forniti a livello locale da parte delle cellule vicine o più distanti da un centro embrionale di segnalazione, sono responsabili di indurre specifici tipi di tessuto ed il modello quasi ogni organo del sistema. Esempi di centri di segnalazione comprendono l&#39;organizzatore / nodo nella gastrula che induce ectoderma neurale e il mesoderma modelli, e la zona di attività polarizzante che il pattern asse anteriore-posteriore del germoglio dell&#39;arto. Sebbene le mappe destino identificare i precursori dei diversi organi e rivelano il percorso di sviluppo adottate dai propri discendenti in embrione normale, non in grado di distinguere tra intrinsecae le influenze estrinseche su tali cellule. Inoltre, non rivelano il potenziale di sviluppo di una cella, i cui discendenti differenziare in un ambiente complesso di segnalazione dell&#39;embrione. Due approcci sperimentali può verificare se il destino di una cellula è determinata da fattori intrinseci o successivamente viene influenzata da fattori esterni: 1) trapianto di cellule in una posizione romanzo nell&#39;embrione, o 2) la rimozione della cellula dall&#39;embrione seguita da coltura in assenza di segnali esogeni. Entrambi gli approcci sperimentali sono realizzabili in Xenopus perché le cellule sono abbastanza grandi da essere separati manualmente. Per esempio, numerosi studi hanno cancellato singole cellule da embrioni (per cambiare interazioni cellula-cellula) o le cellule trapiantate a posizioni nuove in embrioni di accoglienza per verificare i cambiamenti destino (recensione in 7, 8, 9). Inoltre, il secondo approccio di espianto piccolo numero di cellule provenienti da diverse regioni dell&#39;embrione icultura nto di chiarire le interazioni tissutali induttivi in assenza di fattori esogeni è possibile perché le cellule dell&#39;embrione Xenopus sono riempiti con un archivio intracellulare dei nutrienti, le piastrine tuorlo. Pertanto, essi possono essere coltivate per alcuni giorni in un mezzo definito sale senza integrazione nutrizionale o fattore di crescita del mezzo di coltura. Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che blastomeri animali dorsali hanno una capacità autonoma di produrre tessuti mesodermiche neurali e dorsale a causa di ereditarietà materna mRNA 10, 11, e altri hanno dimostrato che le specifiche mesoderma di 32 cellule blastomeri si basa su informazioni sia intrinseco ed estrinseco 12 . Un vantaggio di coltura di cellule come espianti è che il mezzo può anche essere integrato con segnalazione definiti fattori per determinare quale cellula-cellula percorso di comunicazione potrebbe influenzare il destino della cellula espiantato 12, 13, 14. Inoltre, si può iniettare la pr blastomeroior alla cultura con mRNA a un eccesso di esprimere un gene, o con oligonucleotidi anti-senso per evitare la traduzione di mRNA endogeni. Questi, guadagno e perdita di funzione di analisi in grado di identificare le molecole che sono necessarie per un destino autonomamente espressa. Per analizzare il destino della espianto, identificazione di specifici tipi cellulari possono essere eseguite da espressione genica standard (ad esempio, ibridazione in situ, RT-PCR) e saggi di immunocitochimica. Questo protocollo fornisce un semplice, ma potente, modo di distinguere tra i meccanismi intrinseci ed estrinseci che regolano una cellula embrionale si sviluppa nei tessuti specifici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Alumina pellicola abrasiva </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-38 </td><td> Corso (12 micron), per riparazioni importanti consigli di forcipe </td></tr><tr><td> Alumina pellicola abrasiva </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-46 </td><td> Medio (3 micron), per fini affilatura di punte Pinza </td></tr><tr><td> Alumina pellicola abrasiva </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-54 </td><td> Fine (0,3 micron), per la lucidatura di punte Pinza </td></tr><tr><td> Pinza: Dumont, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> # 11252-30 </td><td> Questi hanno le punte sottili che non hanno bisogno di affilatura al primo acquisto. Resistente alla corrosione in modo che possanoessere sterilizzati in autoclave. </td></tr><tr><td> Gentamicina soluzione </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Aggiungi ai media il giorno stesso in cui l&#39;uso </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Mappe destino, costruiti lineage tracing tutte le cellule di un embrione, rivelano che i tessuti discendere da ciascuna cellula dell&#39;embrione. Sebbene le mappe destino sono molto utili per identificare i precursori di un organo e per chiarire il percorso di sviluppo da cui le cellule discendenti popolano quell&#39;organo nell&#39;embrione normale, non illustrano il potenziale di sviluppo di una cellula precursore o identificare i meccanismi con cui il suo destino è determinato. Per eseguire il test per l&#39;impegno il destino delle cellule, si confrontano normale repertorio di una cellula di discendenti nell&#39;embrione intatto (la mappa destino) con quelli espressi dopo una manipolazione sperimentale. E &#39;il destino della cellula fissa (impegnato) indipendentemente dall&#39;ambiente circostante cellulare, o è influenzato da fattori esterni, forniti dai suoi vicini? Utilizzando le mappe complete destino dell&#39;embrione Xenopus, si descrive come identificare, isolare e cultura singoli precursori stadio scissione, chiamato blastomeres. Questo approccio permette di valutare se queste cellule precoci sono impegnati nel fato che acquistano nel loro ambiente normale nell&#39;embrione intatta, richiedono interazioni con le loro cellule vicine, o possono essere influenzate esprimere sorti alterne se esposto ad altri tipi di segnali.

La capacità di questo test per valutare con precisione il potenziale di sviluppo della cellula si basa su sezionando il blastomero corretta in base al destino mappe 1, 2, 3, 4, 5, 6. Pertanto, è fondamentale scegliere embrioni con il pattern pigmentazione corrette al 2-cellula fase, come illustrato nella figura 1, che successivamente sono conformi ai modelli di scissione regolari, come illustrato nella figura 2. Se si osservano gli embrioni classificate come non giungono al...

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell&#39;embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

blastomere-explants-to-test-for-cell-fate-commitment-during-embryonic

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15.2K Views.  The George Washington University. Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell'embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

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Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

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Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Un approccio pratico alla mappatura genetica Destino inducibile: una guida visiva a Mark e Pista Cellule In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l&#39;embriogenesi

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

L&#39;uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...