Molti antigeni vaccini a subunità candidati sono proteine di membrana. Storicamente, questi sono stati difficili da produrre e purificare in quantità sufficienti. Con questa tecnica, siamo in grado di creare antigeni di interesse incorporati all'interno di una membrana lipidica per contribuire a garantire una conferma nativa.
Questo processo facilita anche la formulazione con coadiuvanti di interesse. L'espressione libera da cellule consente una rapida produzione di proteine di interesse nella loro struttura nativa senza tag. Questa tecnica è anche scalabile e stiamo già lavorando con aziende commerciali per lo sviluppo di formulazioni di vaccini utilizzando questo processo.
Dimostriamo qui il processo per un antigene della clamidia, ma il processo potrebbe essere facilmente adattato per produrre antigeni di interesse indipendentemente dal fatto che siano o meno proteine di membrana. Questo processo può essere applicabile sia allo sviluppo di agenti patogeni che di vaccini contro il cancro. Per iniziare, preparare i MOMP-tNLP utilizzando un metodo privo di cellule.
Scongelare il tampone di ricostituzione dal kit di espressione proteica libera da cellule due ore prima di impostare la reazione e aggiungere inibitore della proteasi privo di EDTA al tampone. Utilizzare un kit progettato per eseguire cinque reazioni da un millilitro. Per ogni reazione da un millilitro, aggiungere 525 microlitri di tampone di ricostituzione al flacone di lisato di E.coli e arrotolarlo per dissolverlo.
Aggiungere 250 microlitri del tampone di ricostituzione al flacone di reazione contenente l'additivo e sciogliere arrotolando. Quindi, aggiungere 8,1 millilitri di tampone di ricostituzione al flacone di alimentazione di reazione e arrotolarlo per dissolverlo. A una bottiglia di miscela di aminoacidi, aggiungere tre millilitri di tampone di ricostituzione per scioglierlo.
Ad un'altra bottiglia di metionina, aggiungere 1,8 millilitri di tampone di ricostituzione, scioglierlo e conservarlo sul ghiaccio. Aggiungere 225 microlitri della miscela ricostituita, 270 microlitri della miscela di aminoacidi ricostituita senza metionina e 30 microlitri di metionina ricostituita al flacone di lisato di E.coli. Inoltre, aggiungere 400 microlitri della miscela DMPC / telodendrimer 15 microgrammi di plasmide MOMP e 0,6 microgrammi di delta-49ApoA1 alla miscela e mescolare.
Aliquot 20 microlitri della soluzione totale in un tubo da 1,5 millilitri Per una reazione di controllo che esprime GFP. Preparare una soluzione di mangime aggiungendo 2,65 millilitri della miscela di aminoacidi ricostituita senza metionina e 300 microlitri di metionina ricostituita. Trasferire un millilitro della soluzione di reazione nella camera di reazione interna nel kit di reazione privo di cellule e sigillarlo.
Riempire la camera esterna del recipiente di reazione con 10 millilitri della soluzione di alimentazione e chiuderla. Aggiungere 0,5 microlitri del plasmide di controllo GFP alle aliquote da 20 microlitri della miscela di reazione. Metti la reazione in uno shaker a 300 rotazioni al minuto per 18 ore a 30 gradi Celsius.
Monitorare la reazione sotto una luce UV dopo 15 minuti per la fluorescenza dovuta alla sintesi di GFP. Purificare il complesso di nanoparticelle MOMP-tNLP dalla miscela di reazione priva di cellule mediante cromatografia di affinità di nichel immobilizzato utilizzando il tag HIS-sulla proteina delta-49ApoA1. Trasferire un millilitro del 50% di liquame della resina di purificazione HIS-tag su una colonna cromatografica monouso da 10 millilitri e aggiungere tre millilitri di tampone legante per equilibrare.
Successivamente, scaricare il tampone e aggiungere 250 microlitri di tampone legante alla resina. Estrarre 20 microlitri della miscela di reazione cell-free per l'analisi SDS-PAGE. Aggiungere la restante miscela di reazione priva di cellule con la resina equilibrata e incubare su un bilanciere da laboratorio per un'ora a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il tappo della colonna e lavarlo con 500 microlitri di tampone legante. Aggiungere il liquido di lavaggio alla colonna e raccogliere il flusso per l'analisi SDS-PAGE. Lavare la colonna con un millilitro di tampone di lavaggio con imidazolo 20 millimolare sei volte e raccogliere le frazioni.
Durante il lavaggio per la seconda volta, utilizzare una pipetta da un millilitro per agitare la resina. Eluire i MOMP-tNLPs in sei frazioni da 300 microlitri di tampone di eluizione I contenente imidazolo da 250 millimolari e un'eluizione finale con 300 microlitri di tampone di eluizione II contenente imidazolo da 500 millimolari. Alla seconda eluizione, agitare vigorosamente la resina pipettando su e giù usando una pipetta da un millilitro.
Utilizzare un imager gel per catturare le immagini a 600 nanometri. Quindi, quantificare la quantità di diverse proteine nelle nanoparticelle attraverso l'analisi SDS-PAGE utilizzando uno standard proteico. Disegnate una curva standard utilizzando le densità delle bande MOMP.
Quindi, determinare il componente MOMP delle nanoparticelle con lo standard. Risolvere i campioni tramite SDS-PAGE e trasferire le pile di gel utilizzando un sistema commerciale di dry blotting per l'analisi Western blot. Rimuovere le macchie dalla pila e incubarle durante la notte a quattro gradi Celsius in un tampone bloccante contenente 0,2% TWEEN 20 e 0,5 microgrammi per millilitro MAb40, o 0,2 microgrammi per millilitro MAbHIS anti-tag anticorpo diretto contro il tag HIS-dalla proteina delta-49ApoA1.
Lavare ogni macchia con PBST tre volte per cinque minuti per lavaggio. Incubare le macchie per un'ora in un tampone bloccante contenente anticorpi secondari coniugati a un fluoroforo in una diluizione di 1:10.000. Ripetere i lavaggi con PBST e acquisire l'immagine utilizzando un imager a fluorescenza dopo il lavaggio finale.
Utilizzando un apparecchio dot blot, asciugare tre microgrammi di MOMP-tNLP e svuotare tNLP. Sviluppa e blocca le macchie usando lo stesso metodo per il Western blotting. Congelare la soluzione mista su ghiaccio secco e liofilizzarla durante la notte usando un liofilizzatore.
Conservare le formulazioni essiccate a meno 20 gradi Celsius. Quando necessario, ricostituire i tNLP liofilizzati con acqua priva di endotossine e arrotolarli per dissolversi e reidratarli. Dializzare la soluzione con PBS e rimuovere il trealosio con una membrana di dialisi da 3,5 kilodalton.
Centrifugare la soluzione di nanoparticelle in un concentratore di vuoto prima di aggiungere l'adiuvante. Monitorare il volume del campione dopo 20-30 minuti per evitare la completa essiccazione. In un armadio di biosicurezza, aggiungere l'adiuvante in condizioni sterili.
Utilizzando la cromatografia analitica di esclusione delle dimensioni, analizzare la formulazione per un'incorporazione di successo. Conservare i MOMP-tNLP adiuvati e svuotare il tNLP a quattro gradi Celsius per un massimo di 14 giorni. Analizzare la stabilità della formulazione di tNLP con cromatografia ad esclusione dimensionale.
L'analisi SDS-PAGE di MOMP-tNLP è stata effettuata attraverso la cromatografia di affinità di nichel, che ha dimostrato che la miscela di reazione cellula-libera ha alti livelli di espressione sia per le proteine MOMP che per le proteine delta-49ApoA1. Utilizzando la densitometria su gel, la concentrazione di MOMP è stata quantificata utilizzando un MOMP ricombinante purificato con una concentrazione nota come standard. Per determinare la formazione di oligomeri, SDS-PAGE MOMP e MOMP-tNLP sono stati trattati con calore e DTT, che hanno mostrato bande distinte per MOMP e delta-49ApoA1.
L'analisi Western blot utilizzando un anticorpo MAb40 è stata impiegata contro la proteina MOMP, che ha rivelato un pattern di banding che conferma la formazione di oligomeri da parte della proteina MOMP nel suo stato non denaturato. Un test dot blot è stato effettuato in presenza di anticorpi MAb40 e MAbHIS, che hanno indicato la formazione di MOMP-tNLP. Tuttavia, il tNLP vuoto ha mostrato un segnale positivo per MAbHIS.
I sieri dei topi immunizzati iniettati con MOMP-tNLP adiuvato hanno dimostrato un forte legame MOMP e hanno indicato che MOMP-tNLP potrebbe suscitare una risposta immunitaria. Poiché questo protocollo genera proteine dal DNA, è essenziale evitare di contaminare la reazione con DNasi, RNasi, così come il DNA e l'RNA estranei. Tutti i materiali o i reagenti utilizzati nelle reazioni devono essere privi di questo tipo di molecole.
Dopo l'espressione, la purificazione e l'aggiunta di adiuvanti, questi candidati vaccini possono essere valutati in modelli animali appropriati per i patogeni di interesse per valutare i marcatori di attivazione immunitaria o valutare la protezione durante una sfida. Per la clamidia, la principale proteina della membrana esterna, o MOMP, è stata considerata un antigene candidato principale per i vaccini a subunità per molti anni, ma è stata difficile da produrre su scala necessaria per l'applicazione del vaccino. La co-espressione senza cellule di questa proteina di membrana è un modo praticabile per iniziare a spostare questa proteina verso la valutazione in modelli animali come i topi e, infine, andare in test sull'uomo.
