Vedere la Figura 1 per un esempio che riassume il seguente protocollo. Nota di sicurezza: Tutto il materiale che è stato in contatto con particelle virali assemblato deve essere disinfettata con soluzione disinfettante Virkon o altro idoneo. 1. La preparazione delle scorte DNA plasmidico (~ 2 giorni) <ol><li> I plasmidi sono necessari i seguenti 1: <ul><li> pRV1 - contenenti la Rep AAV2 e sequenze Cap </li><li> PH21 - contenenti il ​​AAV1 Rep e le sequenze Cap </li><li> pFdelta6 - Adenovirus-helper plasmide </li><li> Plasmide contenente la cassetta AAV ricombinante espressione affiancato da AAV2 segnali imballaggio (ripetizioni terminali invertite, ITRS) </li></ul></li><li> Mentre pFdelta6 dovrebbero essere coltivate in Stbl2 cellule competenti per impedire la cancellazione parziale, pRV1 e PH21 può essere coltivata in cellule DH5alpha competenti. Plasmidi AAV può essere coltivata in cellule Stbl2 se delezioni parziali si verificano nelle cellule DH5alpha. </li><li>DNA plasmidico deve essere di alta qualità e privo di contaminanti RNA. Plasmidi possono essere sottoposti a screening per l&#39;integrità utilizzando i seguenti riassunti: <ul><li> pRV1 - digerire con XbaI per dare bande di 7,5 kb e 3,8 kb </li><li> PH21 - digestione con EcoRI per dare bande di 4,5 kb, 2,8 kb e 0,2 kb </li><li> pFdelta6 - digerire con HindIII per dare bande di 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2.3 kb e 1,5 kb </li></ul></li></ol> 2. Preparazione di cellule embrionali umane del rene 293 (HEK293) per trasfezione (2 - 3 giorni) <ol><li> Piastra di due 80% confluenti 150 centimetri due fiaschi di cellule HEK293 15 centimetri in cinque piatti del tessuto diametro cultura Nunc. Le cellule devono essere 70 - 80% confluenti prima trasfezione (circa 48 ore dopo placcatura). Cellule in coltura standard di Dulbecco modificato (DMEM) con glucosio contenente il 10% di siero fetale bovino e 100 U / ml di penicillina / 100 mg / ml di streptomicina. </li><li> 3 ore prima della trasfezione rimuovere e sostituire con DMEM Iscove&#39;Medium s modificato Dulbecco (IMDM) contenente 5% di siero fetale bovino. </li></ol> 3. Trasfezione di plasmidi virali (~ 1 ora per la trasfezione, 3 giorni di incubazione) <ol><li> Preparare la seguente per un singolo lotto (5 x 15 cm piastre di coltura dei tessuti) di virus: <ul><li> 62,5 mcg plasmide AAV </li><li> 125 mcg pFdelta6 </li><li> 31,25 mg pRV1 </li><li> 31,25 mg PH21 </li><li> 1650 microlitri 2,5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> In un filtro 2 classe cappuccio coltura tissutale sterile la miscela di trasfezione in una provetta da 50 ml. </li><li> Vortex, mentre la soluzione, aggiungere rapidamente 13 ml di 2 HEPES x salina tamponata (pH 7,05). Sostituire il coperchio del tubo da 50 ml e continuare a vortex per 15 secondi. Lasciare riposare per 1 minuto 45 secondi, un precipitato fine e bianca dovrebbe formare. </li><li> Delicatamente aggiungere 5 ml di soluzione di trasfezione per ogni piatto 15 colture di tessuti cm. Piastre agitare e tornare alla incubatrice. </li><li> 16 ore dopo la trasfezione rimuovere media IMDM e sostituirlo con DMEM. </li></ol> 4. Lisi delle cellule e la raccolta di rAAVs (2 ore) <ol><li> 72 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto da piastre di coltura cellulare e scartare. Tutti i rifiuti devono essere trattati con soluzione disinfettante Virkon o altro idoneo. </li><li> Lavare delicatamente le cellule in caldo 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7,4). </li><li> Aggiungere 25 ml di PBS caldo a ogni piatto e rimuovere delicatamente le cellule con un raschietto cellula. Raccogliere sospensione in provette da 50 ml. </li><li> Cellule pellet a 800 xg per 10 minuti. </li><li> Gettare il surnatante e risospendere pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8.0, utilizzare 10 ml per piastra di coltura tissutale. Diviso in due provette da 50 ml. </li><li> Preparare una soluzione fresca di deossicolato di sodio al 10% in DH 2 O. Aggiungere 1,25 ml di questo per ogni provetta per una concentrazione finale di 0,5%. Aggiungi benzonasi nucleasi ad una concentrazione finale di 50 unità per ml. Mescolare accuratamente tubo. </li><li&gt; Incubare a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 3000 xg per 15 minuti. Trasferimento a fresco tubo da 50 ml, garantisce tutti i detriti delle cellule è stata rimossa per evitare il blocco delle colonne eparina (vedi punto 5). In questa fase, i campioni possono essere conservati a -20 ° C prima di continuare. Abbiamo conservato i campioni per diverse settimane a -20 ° C senza una riduzione della infettività. </li></ol> 5. Colonna di purificazione eparina rAAVs (2 - 3 ore) <ol><li> Setup HITRAP colonne eparina utilizzando una pompa peristaltica in modo che le soluzioni di flusso attraverso la colonna a 1 ml per minuto per i passi 5,2-5,4. E &#39;importante garantire l&#39;assenza di bolle d&#39;aria sono introdotti nella colonna eparina. </li><li> Equilibrare la colonna con 10 ml di 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Applicare 50 ml di soluzione di virus alla colonna e lasciar fluire. </li><li> Lavare la colonna con 20 ml di 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Usando una siringa da 5 ml di continuare a lavare la colonna with 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0, seguito da 1 ml 300 mm NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Gettare il flow-through. </li><li> Con 5 ml siringhe ed eluire una leggera pressione il virus dalla colonna mediante l&#39;applicazione di: <ul><li> 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 </li><li> 3,0 ml 450 mm NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 </li><li> 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 </li><li> Raccogliere questi in una provetta da centrifuga da 15 ml. </li></ul></li></ol> 6. Concentrazione e filtrazione sterile di rAAVs (1 ora) <ol><li> Concentrato vettoriale utilizzando Amicon unità centrifughe ultra-4 filtro con un cut-off 100.000 peso molecolare. Carico di 4 ml di eluato della colonna nel concentratore e centrifugare a 2000 xg per 2 minuti (a temperatura ambiente). Eliminare eluato e concentratore ricaricare con la soluzione antivirus rimanente e centrifugazione ripetere. Il volume concentrato dovrebbe essere di circa 250 microlitri. Se il volume è molto concentrato più di questo, scartare il flusso tttraverso e continuano a centrifuga a intervalli di un minuto fino a quando il volume è di circa 250 microlitri. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di PBS al virus per un volume finale di 500 microlitri e togliere dal concentratore. </li><li> Vettore filtrare da 13 mm di diametro filtro da 0,2 micron siringa. Vettore deve essere aliquotati e conservati a -80 ° C fino al momento. </li></ol> 7. Titolazione degli stock virale (3 giorni) Ciò richiede un promotore che è attiva in cellule HEK293 guida di un gene reporter o un prodotto del gene immunocytochemically rilevabile. Quando si produce un vettore che non è compatibile con cellule HEK293 altre linee cellulari o colture cellulari primarie possono essere utilizzati. <ol><li> Preparare 18 poli-L-lisina coprioggetto vetro rivestito o 18 pozzi di diapositive camera Nunc da semina HEK293 cellule in modo che siano 40 - 50% confluenti. Per la titolazione di Cre-dipendente rAAVs uso HEK293 cellule che esprimono stabilmente Cre ricombinasi 2. </li><li> Infettare ogni pozzetto con serie dilutions del vettore AAV (Fig. 2A). Utilizzare 3 pozzi per diluizione. Noi abitualmente aggiungere virus direttamente a ciascun pozzetto. </li><li> Dopo 72 ore riparare cellule HEK293 con l&#39;aggiunta di un volume pari al 4% paraformaldeide (PFA) e medie (dando una concentrazione finale del 2% PFA) per dieci minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule per tre volte in PBS, sciacquare in dH 2 O e coprioggetto. </li><li> Contare il numero di cellule trasdotte dai tre pozzi che hanno il più alto fattore di diluizione, ma contengono ancora cellule infettate, trovare la media di questi e moltiplicare per il fattore di diluizione per dare il numero di unità infettive per microlitro (Fig. 2B). </li></ol> 8. Risultati attesi HEK293 cellule trasdotte con una codifica virus sono mostrati maggiore proteina verde fluorescente (eGFP) in Figura 2B. In genere ottenere titoli coerenti di circa 6 x 10 6 particelle infettive per litro micro. Noi abitualmente utilizzano questi vettori per stereotassica injection nel cervello di roditori adulti. Questo fornisce una potente tecnica per la regione specifica espressione genica 2. Per combinare questa specificità regione con cellule di tipo selettivo l&#39;espressione genica abbiamo iniettare ricombinasi Cre-dipendente rAAVs nelle regioni obiettivo di Cre-topi transgenici 2. Figura 2C-E mostra esempi di iniezioni stereotassico di Cre-dipendente rAAVs codifica eGFP in differenti regioni del cervello adulto di parvalbumina Cre-topi transgenici 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> Figura 1. Illustrazione schematica del protocollo per la produzione di rAAV. . 1) HEK293 cellule sono placcati e cresciuto fino a 70-80% confluenza. 2.) AAV e plasmidi helper sono preparati e trasfettati in cellule HEK293. 3.) Media viene ripristinata DMEM 16 ore dopo la trasfezione e HEK293 le cellule sono coltivate per un altro 56 ore. 4.) HEK293 cellule vengono raccolte e lisate. rAAV vettori sono separati da detriti cellulari da centrifugation. 5.) Particelle virali sono purificati attraverso colonne di eparina prima la concentrazione e la sterilizzazione. 6.) HEK293 cellule sono coltivate su ben 24 tavole ed infettare con diluizioni seriali del vettore AAV per determinare il numero di unità infettive. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> Figura 2. Titolazione e in applicazione in vivo di rAAV1 / 2. (A) installazione di cellule HEK293 per la misurazione titolo virale. HEK293 cellule vengono trasdotte con diluizioni seriali di rAAVs. C, il controllo non infettate, N, 1 ml di diluito magazzino virale. (B) HEK293 cellule infette con rAAVs esprimere eGFP. (CE) espressione eGFP virale è limitato a Cre-esprimere i neuroni in regioni diversi target di parvalbumina Cre-topi transgenici dopo l&#39;iniezione stereotassica di Cre-attivi rAAVs. Immagini esempi mostrano immunoreattività GFP in (C) il pallido reticolare talamo e globus, (D) il giro dentato e (E) la regione CA1 dell&#39;ippocampo. DG, dentate giro, RT, nucleo reticolare del talamo; GP, globo pallido. Bar Scala: B, 500 micron, C, 100 micron, D, 100 micron; E, 500 micron.

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	<li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats.">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li><li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li><li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li><li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+type+6+(AAV6)+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors.">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li><li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6.">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li><li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+serotype+1,+2,+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li><li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li><li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1.">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li><li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain.">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li><li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector:+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain.">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li><li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences.">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li><li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins.">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li><li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity.">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li><li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates.">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li><li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector.">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+(Tet)+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors.">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

vettori rAAV stanno diventando sempre più prezioso per studi in vivo su animali. Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice e poco costoso per produrre rAAVs, che possono agevolare l&#39;applicazione diffusa di questo vettore utile evitando l&#39;esternalizzazione dei costi di produzione del virus alle aziende. Il protocollo (sulla base di riferimento 1) descrive la produzione di chimerico rAAV1 / 2 vettori contenenti proteine ​​del capside da entrambi i sierotipi dei genitori con rapporti uguale a 4. La purificazione dei vettori rAAV legandosi alle colonne eparina si affida l&#39;espressione delle proteine ​​del capside AAV2, ma può essere combinato con altri sierotipi di AAV1 qui esposti. Inoltre, AAV6 è stato riportato che lega l&#39;eparina, anche se con una ridotta affinità, e potrebbe potenzialmente essere purificato con colonne di eparina utilizzando questa procedura 5,6. Va notato tuttavia, che altri sierotipi richiederà diverse concentrazioni di NaCl per l&#39;eluizione colonna eparina 5,7. Packaging genomi rAAV ha dimostrato di essere ottimale tra 4,1 e 4,9 kb con una forte riduzione in termini di efficienza imballaggio fino a 5.2 kb 8. Questo limite imballaggio può essere considerato il più grande svantaggio del sistema rAAV, dal momento che tipo specifico di cellule regolazione dell&#39;espressione del transgene è di solito realizzato da cis grandi agendo elementi che non possono essere ospitati all&#39;interno della AAV particelle di piccole dimensioni. Per superare i lotti basso titolo, come quelle derivanti dal tentativo di geni pacchetto che sono vicini al limite di imballaggio AAV stiamo combinando separati lotti virale concentrato di 250 microlitri in lotti da 500 microlitri, piuttosto che aggiungere PBS come descritto al punto 6.3. Affidabile di cellule di tipo specifico di trasduzione può essere ottenuto combinando Cre-driver topi e cassette rAAV condizionale (vedi sotto) per evitare che si estende il limite di confezionamento. Da notare che mentre questo protocollo cerca di fornire facili da seguire le istruzioni sulla produzione di alta titer rAAV, richiede la presenza di frazioni AAV2 proteina del capside di purificazione da eparina cromatografia di affinità. Sierotipi diversi da quelli AAV2 deve essere purificato con procedure alternative 9. Un vantaggio di purificazione colonna eparina è si ritiene di produrre vettori AAV che hanno tasso di infettività superiori a quelle prodotte mediante gradiente di cesio cloruro di 10. Tuttavia, ci sono anche alcuni svantaggi di questo metodo. Per esempio, altre proteine ​​che legano l&#39;eparina può essere presente anche il brodo purificato virale. Mentre il tropismo di eparina-purificata vettori possono essere influenzati dal titolo vettore 10, il nostro approccio per indirizzare specificamente, sia eccitatorio 20 o neuroni inibitori (Fig. 2) impiega Cre-indotto l&#39;attivazione di AAV-mediata ed è espressione del transgene titolo indipendente. Un&#39;alternativa alla purificazione colonna eparina è l&#39;uso di un gradiente di densità Iodixanolo, che produce un più elevato titolo virale e la preparazione più pura l&#39;uso diun gradiente di cloruro di cesio 10. Questo metodo può anche essere combinato con la purificazione della colonna eparina per produrre un vettore che è superiore al 99% puro 11. Pertanto, un&#39;attenta valutazione deve essere presa dai singoli gruppi su quale metodo di purificazione virale è meglio per il loro particolare applicazione a valle. Il problema più comune associato a questo protocollo è basso titolo virale. Nella nostra esperienza questa di solito può essere ricondotti a bassa efficienza di trasfezione, o l&#39;eluizione del virus dalle colonne eparina. Tutti i materiali transfezione devono essere a temperatura ambiente prima di transfezione, e trasfezioni test deve essere eseguito per trovare le condizioni ottimali in ogni laboratorio. Altri metodi di trasfezione, come Lipofectamine, sono altamente efficienti, ma può essere proibitivo. Inoltre, la concentrazione e del pH delle soluzioni di eluizione colonna eparina è un fattore critico per l&#39;eluizione completa dei virioni da eparina se nza preavviso colonneut danni. Un altro punto importante è che le cellule imballaggio deve aderire bene alla superficie dei piatti della cultura del tessuto. Se le cellule staccarsi a un certo punto durante la procedura si consiglia di interrompere l&#39;esperimento e sbrinamento un nuovo flacone di cellule. Spazio-temporale di controllo di espressione del transgene nei roditori è facilmente ottenibile con targeting anatomico preciso e lo stadio di sviluppo dell&#39;animale. Efficiente AAV-mediato il trasferimento genico ha dimostrato in utero 12,13. Nel cervello adulto, la zona infetta con particelle rAAV dopo l&#39;iniezione stereotassica può essere regolata da regioni oggetto molto piccolo, ad aree molto più grandi, non solo dai cambiamenti titolo virale, ma anche modificando i parametri di iniezione. Questi includono il volume e la velocità delle iniezioni e l&#39;inclusione del mannitolo poliolo con la sospensione di virus 14. Mannitolo può essere utilizzato anche per migliorare l&#39;infezione di una varietà di tessuti, dopo l&#39;iniezione sistemica rAAV 15 &lt;/ Sup&gt;. La capacità di confezionamento di rAAV (circa 4,7 kb) è probabilmente il fattore più limitante in termini di geni che possono essere espressi da questi vettori virali. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che questo può essere in parte superati da geni suddivisione più grandi o più cassette di espressione in vettori separati rAAV e l&#39;introduzione di una sequenza di bridging, di iniziare l&#39;espressione genica quando virioni di infettare la stessa cellula 16. Livelli di espressione di geni trasportati da vettori rAAV può essere notevolmente migliorata mediante auto-omaggio vettori rAAV 17. Iniezione stereotassica di vettori rAAV fornisce un metodo rapido, poco costoso e potente per indurre l&#39;espressione genica in una regione specifica maniera. In combinazione con 2 ° generazione di strategie di RNA interference 18 rAAVs può essere utilizzato anche per la regione di specifici geni abbattere. rAAVs può essere combinato con Cre-topi transgenici o promotori specifici delle cellule di tipo a commutazione di circuito ea ottenere cellule di tipoSpecifici per l&#39;espressione genica, permettendo manipolazioni genetiche ad alta risoluzione spaziale 2,19-21, mentre rAAVs raccordo con ad esempio il sistema tet aggiunge il controllo temporale sulla virus-mediata espressione genica 22,23. Questi esempi illustrano le enormi potenzialità combinatorie di questi vettori e prevedere un rapido aumento rAAV studi basati negli anni a venire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Amicon filtri Ultra centrifuga </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100.000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonasi nucleasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco ha modificato (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Supplemento con il 10% di FCS e 10 unità / ml penicillin/100 mcg / ml di streptomicina </td></tr><tr><td> Cellule HEK293 </td><td> Americano tipo raccolta delle colture </td><td> CRL-1573 </td><td> Uso al passaggio meno di 30 </td></tr><tr><td> HEPES salina tamponata </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HITRAP Eparina cartuccia </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Iscove ha modificato Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Supplemento con il 5% FCS </td></tr><tr><td> Sodio desossicolato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Fai la soluzione fresca per ogni lotto </td></tr><tr><td> 15 centimetri di coltura tissutale piatti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 cellule competenti </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon soluzione </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Lascia per disinfettare tutta la notte prima di scartare per drenare </td></tr></tbody></table> Reagenti Tabella 1. Specifiche richieste per il protocollo

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

Negli ultimi anni ricombinante adeno-associato vettori virali (AAV) sono diventati sempre più preziosi per studi in vivo negli animali, e sono anche attualmente testato in studi clinici sull&#39;uomo. Wild-type AAV è un non patogeno membro della famiglia Parvoviridae e intrinsecamente replica-carenti. Il profilo di trasduzione larga, bassa risposta immunitaria e la espressione del transgene forte e persistente ottenuto con questi vettori li ha resi uno strumento popolare e versatile per in vitro e in vivo di consegna del gene. rAAVs possono essere facilmente ea basso costo prodotta in laboratorio e, in base al loro profilo di sicurezza favorevole, sono in genere data una bassa classificazione di sicurezza. Qui, descriviamo un metodo per la produzione e la titolazione di rAAVs chimeriche contenenti le proteine ​​del capside di entrambi AAV1 e AAV2. L&#39;utilizzo di questi vettori chimerici cosiddetti combina i vantaggi di entrambi i sierotipi dei genitori come l&#39;alta scorte titoli (AAV1) e purificazioneda cromatografia di affinità (AAV2). Questi sierotipi di AAV sono i migliori studiato di tutti i sierotipi AAV, e singolarmente hanno un modello ampio infettività. I vettori chimerici qui descritto dovrebbe avere le proprietà infettive del AAV1 e AAV2 e può quindi aspettare che infettare una vasta gamma di tessuti, compresi i neuroni, muscoli scheletrici, pancreas, rene tra gli altri. Il metodo qui descritto usa purificazione eparina colonna, un metodo ritenuto di dare un titolo virale più alta e più pulito preparazione virale rispetto ai metodi di purificazione altre, come la centrifugazione da un gradiente di cloruro di cesio. Inoltre, si descrive come questi vettori possono essere rapidamente e facilmente titolati a dare lettura accurata del numero di particelle infettive prodotte.

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Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Ricombinante adeno-associato virus (rAAVs) vettori stanno diventando sempre più prezioso per<em&gt; In vivo</em&gt; Gli studi su animali. Ci descrivono come rAAVs possono essere prodotti in laboratorio e come questi vettori possono essere titolati a dare una lettura precisa del numero di particelle infettive prodotte.

Produzione e titolazione di vettori virali ricombinanti adeno-associato

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.3K Views.  University of Aberdeen. Ricombinante adeno-associato virus (rAAVs) vettori stanno diventando sempre più prezioso per In vivo Gli studi su animali. Ci descrivono come rAAVs possono essere prodotti in laboratorio e come questi vettori possono essere titolati a dare una lettura precisa del numero di particelle infettive prodotte.

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Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Efficienti di produzione Parvovirus ricombinante con l&#39;aiuto delle Adenovirus sistemi derivati

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Dissezione Innate Immune Signaling in Evasion virale di produzione di citochine

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...