1. Mutagenesi chimica Nota: Abbiamo trovato che la forma replicativa RB è più suscettibile di mutagenesi chimica rispetto alla forma EB. A metà ciclo (tra i 18 a 20 HPI), RBS sono a maggior numeri precedenti RB-EB transizione. Poiché Chlamydia trachomatis è un patogeno intracellulare obbligato, gli effetti del mutageno sulla salute dell&#39;ospite può limitare recupero batterica. Cellule Vero sono stati trovati per essere più resistenti agli effetti negativi di livelli elevati di SME che altre linee cellulari testate. Separazione delle mutazioni di ricombinazione richiede la selezione di progenie ricombinante resistenti agli antibiotici. Si consiglia di utilizzare ceppi resistenti ai farmaci (ad esempio rifampicina, spectinomicina, o trimetoprim) per la generazione di mutanti per la capacità di eseguire analisi ricombinante e di isolare ceppi isogeni. Ceppi resistenti agli antibiotici sono stati generati da un processo di selezione stepwise (15, 16). None: Chlamydia trachomatis (ceppo L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) è BSL2 patogeno. Per la gestione di tali agenti patogeni, consultare le procedure operative standard (SOP istituzionali). <ol><li> Preparazione delle cellule in coltura e l&#39;infezione: <ol><li> Seme di circa 1 x 10 6 cellule Vero (ATCC CCL-81), ogni 25 cm 2 (T25) beuta in 3 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS). Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. Le cellule devono formare un monostrato confluente all&#39;interno di 24 h. </li><li> Aspirare il terreno. Infettare confluenti T25 fiaschi di cellule Vero con Chlamydia ad una molteplicità di infezione (moi) di 5 (~ 14 x 10 6) in un volume totale di 3 ml di medium (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamide, 10% FBS). </li></ol></li><li> Inizia mutagenesi a 18 ore dopo l&#39;infezione (HPI): <ol><li> Preparare 20 mg / ml di EMS (Etil methanesulfonate) in tampone fosfato (PBS) con 0,9 mM di calciocloruro e 0,49 mM di cloruro di magnesio in una cappa di sicurezza chimica, come lo SME è un liquido volatile. Nota: EMS è un potente mutageno e cancerogeno. Neutralizzare SME rifiuti e decontaminare le fuoriuscite, plastica, carta e vetro con 1 M di idrossido di sodio. </li><li> Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 3 ml di PBS / MgCl 2 / CaCl 2. Incubare le cellule con 3 ml di 20 mg / ml in PBS EMS / MgCl 2 / CaCl 2 per un&#39;ora sotto cappa a temperatura ambiente. Cellule Vero sono in grado di sopravvivere a questa concentrazione di SME e condizioni all&#39;esterno dell&#39;incubatrice per brevi periodi. Ricordati di includere un campione di controllo che non è stato mutagenizzate. </li><li> Togliere terreno contenente SME e metterla in un contenitore di 1 M di NaOH per inattivare l&#39;agente mutageno. Lavare le cellule infette 3 volte in 3 ml di PBS + MgCl2 / CaCl 2 per rimuovere mutageno residuo. Aggiungere 6 ml di DMEM/10% FBS con 200 ng ml cyclohexamide / e di 25 mg / ml di gentamicina, e incubare a 5% di CO <sub&gt; 2, 37 ° C per 48-72 ore. Inclusioni appaiono privi di batteri circa 36 ore dopo la mutagenesi. A 72 h circa il 10% delle inclusioni sono pieni di batteri, mentre il resto rimane vuoto. </li><li> Estrarre EBs da lisi ipotonica: aspirare Completamente media. Aggiungere 1,0 ml di H 2 O e rock per staccare le cellule per 10 min. Lisare cellule pipettando su e giù per almeno 10 volte. Raccogliere lisato in una microcentrifuga e aggiungere 0,250 ml 5x saccarosio fosfato tampone glutammato (SPG) per portarlo a 1x concentrazione finale. Conservare a -80 ° C. Nota: il livello di mutagenesi può essere valutata l&#39;induzione di resistenza rifampicina. Per saggiare la frequenza di resistenza rifampicina, placca 1 x 10 x 8 e 7 diluizioni seriali di 10 volte di batteri in presenza di 200 ng / ml di rifampicina. La frequenza di resistenza rifampicina è definito come il numero di placche resistenti es.Rifampin diviso per il numero totale di batteri placcato. Vedere la sezione sottostante per le istruzioni di placca. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento clonale di Chlamydia trachomatis ceppi mutanti dalla placca Purificazione <ol><li> Impostare monostrati confluenti di cellule Vero in 6 pozzetti: Seed ~ 0,4 x 10 6 cellule in 3 ml DMEM/10% FBS per pozzetto. Consentono alle cellule di formare un monostrato omogeneo per il prossimo 24 h. </li><li> Scongelare soluzione stock di Chlamydia mutagenizzato sul ghiaccio. 6 x eseguire diluizioni seriali di 10 volte in un volume totale di 200 microlitri per diluizione in DMEM/10% FBS e quali sono disposti su ghiaccio. Nota: titolo batterica in unità formanti inclusione (IFU) è una buona stima di unità formanti placca (PFU). Obiettivo di placca 10, 100, e 1000 PFU. </li><li> Lavare le cellule Vero due volte con 3 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Aggiungere 3 ml DMEM a ciascun pozzetto per piastre da 6 pozzetti e 100 microlitri delle diluizioni batteriche in duplicato. Agitare la piastra per assicurare una miscela. </li><li> Spin piastre infettate a 2.700 xg per 30 min a 15 ° C e poi incubare a 37 ° C in un umidificata,5% di CO 2 incubatore per 1-2 ore. </li><li> Preparare 0,54% agarosio in DMEM (per 6 pozzi): <ol><li> Aggiungere i seguenti ingredienti: 18,9 ml freddo 2x DMEM, 4,2 ml di FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0.042 ml 200 mg / ml cyclohexamide, 0.021 ml 50mg/ml gentamicina. Mescolare bene. </li><li> Mescolare in 18,9 ml di caldo sterile 1,2% agarosio / H 2 O, mescolando per evitare grumi. Miscela deve essere caldo al tatto. Conservare in un bagno di acqua calda a 55 ° C prima di aggiungere alle cellule infette. </li></ol></li><li> Aspirare sospensione batterica da piatti e applicare 6 ml 0,54% agarosio / DMEM per pozzetto. Lasciare agarosio solidificare completamente a temperatura ambiente fuori dalla cappa per 15 min. Asciugare le piastre con i coperchi rimossi, nella cappa di biosicurezza per 15 min. Nota: Vibrazioni dalla cappa di contenimento biologico può distorcere la solidificazione agarosio. </li><li> Incubare a 37 ° C in CO 2 incubatore per 7-10 giorni. Placche dovrebbero essere visibili con l&#39;aiuto di un microscopio da dissezione. (ReFER alla Figura 3 per una tipica immagine di placche.) </li><li> Un giorno prima isolare mutanti, seme 1 x 10 4 cellule Vero in 100 microlitri per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Le cellule saranno confluenti entro 24 h. </li><li> Utilizzando un microscopio dissezione, marchio placche di essere raccolti. Raccogliere tappi di placche utilizzando un 1,0 ml puntale barriera sterile. </li><li> Placche Risospendere in 100 ml di DMEM supplementato con 10% FBS, 400 ng / ml cyclohexamide, 50 mg / ml di gentamicina. </li><li> Per espandere ceppi mutanti, sovrapporre la sospensione su monostrati confluenti di cellule Vero. Spin piastre a 2.700 xg, 15 ° C per 30 min. </li><li> Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Vendemmia EBs quando&gt; 50% delle cellule sono infettati, che può verificarsi già nel 48 HPI e il più tardi 14 giorni. Questa quantità di cellule infette permette ai batteri abbastanza vitali da memorizzare. Ceppi mutanti si differenziano per tassi di crescita e la loro infettività. Consentire ceppi a crescita lenta per naturally re-infettare le cellule vicine fino a quando abbastanza cellule sono infettate. </li><li> Estrarre EBs da lisi ipotonica delle cellule infette: <ol><li> Aspirare Completamente media. </li><li> Aggiungere 160 ml di acqua sterile. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Disrupt cellule pipettando su e giù diverse volte per garantire la completa lisi, utilizzare puntali per evitare la contaminazione incrociata. </li><li> Trasferire 160 microlitri di lisato di tubi microcentrifuga. </li><li> Miscelare in 40 ml di SPG 5x. Conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Dosaggio e schermo mutanti per fenotipo (s) di interesse. </li></ol> 3. Whole Genome Sequencing dei Mutanti Chlamydia selezionati <ol><li> Estrarre il DNA genomico da gradiente-purificata EBS, che sono in gran parte privo di contaminazione del DNA dell&#39;ospite. Protocolli per cultura su larga scala di Chlamydia e purificazione di EBs possono essere trovati in rif. (17). Utilizzare i kit di purificazione del DNA genomico commerciali (ad esempio Qiagen cat. 69504) per extragiscono DNA da 2 x 10 9 batteri seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Utilizzare un fluorimetro (Qubit, Invitrogen cat. Q32866) per misurare con precisione la quantità di DNA. È richiesta 1-5 mg di DNA purificato per la piattaforma Illumina sequenziamento. Nota: Diverse piattaforme possono essere utilizzate per sequenze genomi batterici, tra cui i sistemi di Illumina/Solexa- e Solid-based. Abbiamo scelto di utilizzare HiSeq (Illumina) in quanto produce alta densità di breve, ma la sequenza di alta qualità si legge. Piccoli sequencer genoma scala, come IonTorrent (Life Technologies) e MySeq (Illumina) sono adatti anche e più che sufficiente per la multiplazione questi quencing di fino a 4 genomi Chlamydia alla volta, che supera la copertura minima di 25X per un&#39;adeguata assemblaggio del genoma. Preparazione di librerie di DNA sequenziamento per la piattaforma Illumina sono descritte di seguito. </li><li> Frammento di DNA di dimensioni adeguate (300-400 coppia di basi per Illumina sequenziamento) utilizzando un Adaptive Acustica Focused S220 instrumento (Covaris) in base alle impostazioni suggerite dal produttore. Nota: la frammentazione del DNA dai risultati di nebulizzazione in una maggiore perdita di campione a causa di aerosol del campione. </li><li> Preparare le librerie di sequenziamento genomico utilizzando kit di costruzione commerciali (Illumina FC-102-1001), seguendo le istruzioni del produttore. Le librerie possono essere indicizzati utilizzando primer codice a barre (Illumina FC-121-1003) che tali campioni multipli possono essere messe in comune e sequenziati contemporaneamente. </li><li> Esegui il sequenziamento dei campioni. Questo passaggio è di solito eseguita da servizi commerciali o strutture centrali gestite da personale tecnico dedicato. Seguire le procedure e le raccomandazioni. </li><li> Illumina letture (formato FASTQ) possono essere assemblati in un genoma di riferimento utilizzando user friendly software di interfaccia grafica utente, ad esempio Geneious (Biomatters), che può essere utilizzato anche per SNP / identificazione mutazione. Per mappare le mutazioni, impostare i parametri per il 90% per la frequenza minima variante e 50X per la copertura minima. Apri Sourcelettroniche genoma assemblatori, come MAQ (18) e BWA (19), possono anche essere usate. </li><li> Confermate le mutazioni da Sanger: utilizzare il DNA genomico come stampo per l&#39;amplificazione PCR di 300-500 bp regioni fiancheggianti mutazioni identificate e sequenza purificati o diluito (1:20) I prodotti di PCR di sequenziamento Sanger. </li></ol> 4. Generazione di ricombinanti Chlamydia Nota: Chlamydia può scambiare DNA durante l&#39;infezione, che consente la generazione di ceppi ricombinanti (12, 13, 20). Dopo la co-infezione di cellule con due ceppi resistenti agli antibiotici unici, ricombinante &quot;progenie&quot; può essere selezionato per il doppio resistenza agli antibiotici (12, 13). Abbiamo approfittato di questo fenomeno per separare le mutazioni e di generare ceppi co-isogenici. Quindi, ceppi mutanti sono stati generati in fondo resistente agli antibiotici (es. rifampicina resistenza (Rif. R) H471Y in CTL0567 (rpoB)) tali da poter essere attraversato a wild type strain bearinga diverso allele resistente agli antibiotici (es. resistenza spectinomicina (SPC R), G1197A nel r01/r02 (16SRNA esemplari 1 e 2)). Per i dettagli riguardanti lo scambio di DNA e ricombinazione in Chlamydia, consultare la Bibliografia (12, 13). <ol><li> Co-infettare wild type e mutanti clonali da centrifuging6 x 10 5 batteri da ogni ceppo su monostrati confluenti di cellule Vero cresciute su una piastra a 24 pozzetti. In parallelo, infettare monostrati con ciascun singolo ceppo. </li><li> Al 44 hpi, raccolto EBs da lisi ipotonica delle cellule infette: <ol><li> Aspirare Completamente media. </li><li> Aggiungere 0,4 ml di acqua sterile e lasciare riposare per 10 min. </li><li> Lyse cellule vigoroso pipettare su e giù per almeno 10 volte. Trasferimento lisati in una provetta. </li><li> Mescolare in 0,1 ml di SPG 5x per una concentrazione finale di 1x SPG. </li><li> Lisato grezzo può essere utilizzato immediatamente o conservato a -80 ° C. </li></ol></li><li> Targa 50 microlitri della EB greggio preps und 5 x 01:10 diluizioni seriali in agarosio / DMEM supplementato con antibiotici appropriati alla selezione di ricombinanti. (Vedi tabella per le concentrazioni di antibiotici tipici per la selezione dei ricombinanti.) </li><li> Targa purificare e arricchire ceppi ricombinanti come sopra. Ricombinanti punteggio per la presenza o l&#39;assenza del fenotipo desiderato. Estrarre il DNA da ceppi ricombinanti mediante trattamento DNAzol (sezione successiva) allo scopo di genotipizzazione per la presenza o assenza di mutazioni. </li><li> Croci possono essere ripetuti con ceppi recanti altri marcatori di resistenza agli antibiotici a segregare ulteriormente mutazioni, e generare ceppi isogeni. Co-infettare ricombinanti selezionati a un altro ceppo selvatico recanti un marcatore antibiotico diverso. </li></ol> Tabella 1: le concentrazioni di antibiotici per la selezione dei ricombinanti: <table border="1"><tbody><tr><th> Concentrazione finale </th><th> Istruzioni di preparazione </th></tr><tr><td> 200 ng / ml di rifampicina </td&gt; <td> Fai 25 mg / ml di brodo di stoccaggio in dimetilsolfossido (DMSO). Portare 200 mcg / ml soluzione di lavoro diluendo il magazzino di stoccaggio con H 2 O. Conservare a -20 ° C al buio. </td></tr><tr><td> 200 mg / ml di trimetoprim </td><td> Fare un mg / ml di brodo di DMSO 100. Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> 200 mcg / ml spectinomicina </td><td> Fare un mg / ml di brodo in acqua 100 in aliquote di 100 microlitri. Conservare a -20 ° C. Evitare cicli ripetuti di gelo-disgelo. </td></tr></tbody></table> 5. Estrazione di DNA genomico da ceppi ricombinanti per la genotipizzazione Nota: I kit di purificazione basato su colonne possono anche essere utilizzati. Un vantaggio di estrazione del DNA da trattamento DNAzol è costato. <ol><li> Infettare 1.2 x 10 5 clamidie su monostrati di cellule Vero coltivate su piastre da 12 pozzetti. </li><li> A 36-48 hpi, aspirare medio e aggiungere 0,375 ml di DNAzol (Invitrogen 10.503-027). Agitare delicatamente le cellule e seminare il LysaTES in una provetta da microcentrifuga 1,5. </li><li> DNA precipitato mediante aggiunta di 0,188 ml di etanolo al 100%. Miscelare per inversione. </li><li> Estrarre DNA da spooling con un puntale e metterla in una provetta pulita. In alternativa, il DNA pellet tramite centrifugazione a velocità massima per 2 minuti a temperatura ambiente oa 4 ° C, e supernatante decantare. </li><li> Lavare DNA precipitato due volte con 1,0 ml di etanolo al 75%. </li><li> DNA aria secca dopo aver rimosso l&#39;etanolo per 15 sec. </li><li> Solubilizzazione del DNA con 0.2 ml di 8 mm di NaOH quindi neutralizzare a pH 8,0 con 20,2 ml di 0.1 M HEPES. Portare ad un volume finale di 0,5 ml con acqua o TE. In alternativa, il DNA risospendere in tampone TE (pellet di DNA non sarà completamente solubilizzata.). </li><li> Utilizzare DNA DNAzol estratte come modello per l&#39;amplificazione PCR di 300-500 bp regioni fiancheggianti mutazioni identificate. Sequenza purificato o diluito (1:20) I prodotti di PCR di sequenziamento Sanger. </li></ol>

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Non c&#39;è nulla da rivelare.

Questa metodologia soddisfa i requisiti di base per l&#39;analisi genetica in quanto stabilisce il collegamento tra genotipi e fenotipi. È importante sottolineare che questo è realizzato senza l&#39;ausilio di strumenti molecolari convenzionali per la trasformazione del DNA ricombinante e inattivazione inserzionale di geni nei batteri, che è spesso una tappa limitante nell&#39;analisi della funzione del gene in microbi non-modello. Un passo fondamentale è quello di garantire clonalità d...

Le intracellulare obbligato batterio Chlamydia trachomatis conti per una stima di 2,8 milioni di infezioni del tratto genitale ogni anno negli Stati Uniti (Center for Disease Control) con associata sequele come la malattia infiammatoria pelvica, gravidanze ectopiche e sterilità (1). Chlamydia spp hanno un unico fisiologia con un ciclo di sviluppo bifasico costituito da due forme: il corpo elementare infettiva ma non replicante (EB) e il corpo reticolato non infettiva ma replicativa (RB). Infezione inizia con l&#39;attaccamento di EBS per cellule epiteliali seguite da endoctyotosis (2). All&#39;interno di un vacuolo di membrana chiamato un&#39;inclusione, EBS differenziarsi in forma RB, che poi si replica per scissione binaria. A metà ciclo, transizioni RBS nuovo in EBS, che vengono poi espulse nello spazio extracellulare di iniziare nuovi cicli di infezione quando i lisi della cellula ospite (3). C. trachomatis èrefrattario alla manipolazione di routine con strumenti genetici molecolari standard, ad esempio la sostituzione mirata del gene, trasposoni, e fagi trasduttori, che sono stati al centro di molti studi di genetica batterica, non è chiaro in che misura i singoli geni Chlamydia contribuiscono alla evasione di immunità innata , l&#39;acquisizione di nutrienti, le transizioni evolutive, o altri processi importanti per la sopravvivenza del patogeno all&#39;interno di un ospite eucariotica (4). Di conseguenza, questo patogeno rimane poco caratterizzato, nonostante la sua importanza clinica. I genomi di Chlamydia spp. sono relativamente piccole (~ 1 Mb) (5), con più specie e biotipi sequenziati usando Avanti tecnologie di sequenziamento generazione. Analisi genomica comparativa di WGS ha fornito intuizioni uniche nella evoluzione della specie Chlamydia e il loro adattamento per l&#39;uomo (6-8) e in qualche misura ha fornito alcune informazioni circa la potenziale funzione di fattori di virulenza (9, 10). Tegli diversità genetica visualizzata da isolati clinici non fornisce la risoluzione richiesta per mappare sistematicamente la funzione della maggior fattori di virulenza, presumibilmente perché tali mutazioni in geni sarebbero stati prontamente contro selezionato. Senza effetti confondenti di selezione naturale, variazione del gene mutageno indotto, insieme con dosaggi definiti che i difetti misurano in virulenza, possono ampliare lo spettro di mutazioni che possono essere esaminati. Mutageni chimici, in particolare, sono utili in quanto possono generare null, condizionale, hypomorphic (ridotta funzione), e hypermorphic (guadagno di funzione) alleli. Con l&#39;arrivo delle tecnologie di sequenziamento del genoma-robusti di prossima generazione, tali mutazioni possono essere facilmente identificati e mappati. In questo modo, le associazioni forti può essere fatta tra mutazioni in un gene o genetico percorso ed un fenotipo comune, consentendo l&#39;applicazione di approcci genetici avanti. Le sequenze del genoma dei ceppi clinici hanno rivelato mosaicismo bra sierotipi ei loci di ricombinazione frequente (11). L&#39;evidenza empirica di ricombinazione è stata dimostrata attraverso la co-infezione di due diversi ceppi resistenti agli antibiotici e la selezione di progenie ricombinante resistente doppio, che si è rivelato di avere contributi genetici di entrambi i ceppi (12, 13). Così, scambio genetico tra ceppi wild type e mutanti in un ambiente co-infezione permette segregazione delle mutazioni indotti chimicamente per individuare il gene alterato che porta al fenotipo osservato. Qui si descrive un metodo per effettuare analisi genetica in Chlamydia base di mutagenesi chimica, WGS, e un sistema di scambio di DNA all&#39;interno delle cellule infettate (14) (Figura 1).

<table border="0" cellspacing="0" cols="4">
	<colgroup width="291">
	</colgroup>
	<colgroup width="123">
	</colgroup>
	<colgroup width="144">
	</colgroup>
	<colgroup width="84">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate (EMS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile, tissue culture grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td>
			<td>Lonzo</td>
			<td>50070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA purification kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10503-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mM NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer (Qubit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, l&#39;agente eziologico di malattie sessualmente trasmissibili e infezioni oculari, rimane poco caratterizzato per la sua intrattabilità di trasformazione sperimentale con il DNA ricombinante. Abbiamo sviluppato un metodo per eseguire l&#39;analisi genetica in C. trachomatis, nonostante la mancanza di strumenti di genetica molecolare. Il nostro metodo prevede: i) la mutagenesi chimica per generare rapidamente ampie librerie di mutanti geneticamente definiti con fenotipi distinti; ii) il sequenziamento dell&#39;intero genoma (WGS) per mappare le lesioni genetiche sottostanti e di trovare associazioni tra gene mutato (s) e.. un fenotipo comune,. iii) generazione di ceppi ricombinanti attraverso la co-infezione di cellule di mammifero con batteri tipo mutante e selvaggio. Di conseguenza, siamo stati in grado di stabilire relazioni causali tra genotipi e fenotipi. L&#39;accoppiamento di variazione del gene indotto chimicamente e WGS per stabilire associazioni genotipo-fenotipo correlativi should essere ampiamente applicabile alla lunga lista di medico ed ecologicamente importanti microrganismi attualmente intrattabili per l&#39;analisi genetica.

L&#39;esposizione a mutageno porta a inclusioni che appaiono privi di batteri, presumibilmente a causa di morte delle cellule batteriche. Tipicamente, sierotipo LGV-L2 sarà completamente lisare le cellule infette entro 48 ore dopo l&#39;infezione, ma il trattamento con agenti mutageni può estendere questo ciclo di&gt; 90 h. Circa il 10% delle inclusioni sono tenuti a recuperare. Nei nostri esperimenti, cellule Vero infettate trattati con 20 mg / ml di EMS portato ad una diminuzione del 99% nel recupero della progenie ...

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Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Descriviamo una metodologia per effettuare l&#39;analisi genetica in Chlamydia sulla base di mutagenesi chimica e il sequenziamento dell&#39;intero genoma. Inoltre, un sistema di scambio di DNA all&#39;interno delle cellule infettate è descritto che può essere utilizzato per la mappatura genetica. Questo metodo può essere ampiamente applicabile a sistemi microbici privi sistemi di trasformazione e strumenti genetici molecolari.

Approcci genetici in avanti<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

12.8K Views.  Duke University Medical Center.  Descriviamo una metodologia per effettuare l'analisi genetica in Chlamydia sulla base di mutagenesi chimica e il sequenziamento dell'intero genoma. Inoltre, un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate è descritto che può essere utilizzato per la mappatura genetica. Questo metodo può essere ampiamente applicabile a sistemi microbici privi sistemi di trasformazione e strumenti genetici molecolari. 

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Scoperta di nuovi agenti patogeni intracellulari da amoebal co-coltura e approcci amoebal arricchimento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Un cellulare semplice Red Blood Metodo Lysis per l&#39;istituzione di B linfoblastoidi linee cellulari

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.