Qui, forniamo un flusso di lavoro che include il miglior metodo bioinformatico per condurre gli esperimenti per valutare l'effetto del glifosato sui microbiomi. Il vantaggio principale è che fornisce una solida ipotesi verificabile per futuri esperimenti sul campo e di laboratorio. La metodologia descritta può essere applicata a una varietà di sistemi, tra cui piante, animali e microbi.
Ogni parte della metodologia è abbastanza semplice. Forse la parte più impegnativa è quella di integrare un team multidisciplinare in grado di eseguire diverse parti del lavoro. A dimostrare la procedura sarà Suni Matthew, un ricercatore del mio laboratorio.
Per iniziare, inizia l'esperimento uno dividendo il campo sperimentale in 10 repliche di controllo e trattamento GBP con fasce tampone di vegetazione tra le trame. Trattare i terreni di controllo con acqua di rubinetto e i terreni GBP con GBP commerciali per imitare il dosaggio massimo consentito di glifosato nelle pratiche agricole. Campionare il microbiota da piante sperimentali.
Raccogliere 10 repliche dei campioni vegetali dal campo, metterli immediatamente sul ghiaccio e portarli in laboratorio per ulteriori lavorazioni. Per l'esperimento due, raccogli lettiere, tra cui trucioli di legno, feci e alcuni mangimi versati da quaglie alimentate con mangimi contaminati da GBP o di controllo in un esperimento di voliera di 12 mesi. Inviare i campioni di lettiera a un laboratorio accreditato per le misurazioni della concentrazione di glifosato direttamente dopo la diffusione.
Pianta piante perenni di erba e fragola in ogni trama per studiare il loro microbiota radicale e fogliare. Identificare e rimuovere i microbi endofiti lavando e sterilizzando i campioni vegetali. Una volta sterilizzati i campioni, estrarre il DNA genomico utilizzando un kit di estrazione del DNA vegetale disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore.
Utilizzando un approccio nidificato, amplificare le regioni variabili da V6 a V8 del gene rRNA 16S e creare un master mix PCR per il numero richiesto di campioni come descritto nel manoscritto di testo. Per il primo round di PCR, utilizzare i primer 799 in avanti e 1492 in retromarcia. Impostare il profilo di amplificazione nel termociclatore per 35 cicli.
Per verificare l'amplificazione, effettuare l'elettroforesi utilizzando cinque microlitri di prodotto amplificato e quindi diluire il resto 25 microlitri del prodotto PCR in acqua ultrapura autoclavata al rapporto di uno a 10. Utilizzando i primer universali 1062 forward e 1390 reverse, condurre il secondo round di amplificazione con 25 cicli. Diluire i prodotti PCR risultanti in acqua ultrapura autoclavata ad un rapporto uguale.
Esegui il terzo ciclo di amplificazione con otto cicli per etichettare i prodotti con i codici a barre e la sequenza dell'adattatore P1. Verificare la concentrazione in qualità dei prodotti PCR su un bioanalizzatore e raggruppare i volumi che costituiscono 30 nanogrammi di DNA di ciascun campione in un tubo da 1,5 millilitri per preparare una libreria equimolare. Seleziona gli ampliconi di dimensioni da 350 a 550 coppie di basi per frazionamento dimensionale utilizzando un sistema automatizzato di selezione delle dimensioni del DNA su una cassetta di gel di agarosio.
Raccogliere l'elute contenente gli ampliconi della dimensione specificata in una fiala nella cassetta risultante in una libreria genica di rRNA 16S purificata. Trasferire l'eluente raccolto in un tubo da 1,5 millilitri e verificare la purezza e la concentrazione sul bioanalizzatore. Diluire la libreria del DNA utilizzando acqua ultrapura autoclavata fino a una concentrazione finale di 26 picomolari.
Per amplificare la regione ITS, dopo aver impostato la reazione con i primer ITS, impostare il profilo di amplificazione sul termociclatore. Quindi analizzare cinque microlitri del prodotto amplificato su gel di agarosio all'1,5% e diluire i restanti 25 microlitri di prodotto nel rapporto da uno a 10 utilizzando acqua ultrapura autoclavata. Crea un mix master PCR per il numero richiesto di campioni con primer in avanti con tag a barre e primer inversi con adattatore P1.
Utilizzando il prodotto PCR diluito come modello, condurre il secondo ciclo di amplificazione. Simile alla preparazione della biblioteca per il gene rRNA 16S, preparare la libreria per la regione ITS purificata. Avviare le analisi bioinformatiche della sequenza proteica EPSPS.
Valutare la potenziale sensibilità della sequenza di query al glifosato dagli output forniti dal server in cui l'output mostra la frazione di marcatori di amminoacidi presenti nelle sequenze di query e il numero di motivi. L'output due mostra gli allineamenti della query e le sequenze di riferimento in base ai residui del marcatore. L'output tre mostra allineamenti completi a coppie delle sequenze di query e di riferimento.
L'output quattro mostra sequenze di riferimento EPSPS di Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis e Streptomyces davawensis. Alla fine della pagina di output, trova i collegamenti a strumenti esterni come BLASTp e domini conservati per analizzare ulteriormente la sequenza EPSPS della query. Dopo aver identificato le sequenze EPSPS dai repository pubblici, accedere a questi set di dati dalla pagina principale del server di classe EPSPS contenente informazioni tassonomiche e dalla classe EPSPS di oltre 50.000 sequenze.
Pesare la biomassa fuori terra delle piante alla fine della stagione di campo per confrontare la crescita delle piante in GBP e controllare gli appezzamenti. In un foglio di calcolo, mappare le OTU batteriche per gli esperimenti sul microbioma in set di dati pre-calcolati. E sulla base di un punteggio probabilistico, calcola la sensibilità intrinseca al glifosato.
Questo metodo è stato utilizzato per quantificare i cambiamenti di sensibilità nella proteina EPSPS a livello micro evolutivo. Abbiamo identificato cambiamenti nello stato di sensibilità in 12 dei 32 gruppi strettamente correlati di procarioti analizzati. Pertanto, l'uso continuo dei prodotti a base di glifosato può produrre disbiosi microbica nei microbiomi vegetali, animali e del suolo.
Garantire la qualità delle procedure pre e post-PCR per ottenere librerie amplicon ottimali. Assicurarsi inoltre che la sequenza proteica EPSPS non sia parziale prima di utilizzare il software. Negli esperimenti sul campo, assicurarsi di prevenire la contaminazione dei controlli con il glifosato.
