L'obiettivo generale di questo protocollo è fornirci una risoluzione elettromicroscopia della distribuzione dell'acqua in vari tipi di cellule xilem in situ. Questo metodo è stato utilizzato per osservare l'acqua in xilelem al fine di chiarire la distribuzione dell'acqua e i regimi idrici mutevoli, la variazione stagionale della distribuzione dell'acqua, l'effetto dei cicli di congelamento /disgelo, la distribuzione dell'acqua nel legno umido e la cavitazione indotta da alcune sollecitazioni biotiche. Il congelamento-fissazione di un tronco vivente sotto alte tensioni idrauliche a volte causa cavitazioni artificiali, che sono osservate dal crio-SEM come cristalli di ghiaccio rotto nel lume del condotto.
Questa procedura aggiornata si concentra sull'ottenimento di micrografie aerotome di alta qualità di xilem senza l'artefatto nella procedura di campionamento. Una dimostrazione praticabile è fondamentale perché ci sono una serie di dettagli importanti che non possono essere facilmente spiegati. Allo stesso tempo, ottenere una formazione non è facile perché solo pochi laboratori in tutto il mondo praticano questo metodo.
Per iniziare questa procedura, racchiudere un ramo e lascia per il campionamento con un sacchetto di plastica nero per equilibrare il potenziale idrico tra xilem e lascia più di due ore prima del campionamento. Utilizzando una camera di pressione, determinare il potenziale idrico di almeno due foglie dal campione. Quando il potenziale idrico è superiore a circa meno 0,5 megapascal, un campione può essere raccolto dopo il congelamento.
Quando il potenziale idrico è inferiore a meno 0,5 megapascal, procedere con il trattamento per il rilassamento. Fissare un collare a tenuta stagna attorno al gambo, che sarà riempito d'acqua. Utilizzando cesoie da potatura o una sega, tagliare lo stelo sotto la superficie dell'acqua e mantenere l'estremità tagliata del campione sott'acqua.
Trasferire il campione in un altro contenitore d'acqua il più rapidamente possibile per ridurre al minimo l'esposizione dell'estremità tagliata all'aria. Per le specie a lati largo, assicurarsi che la lunghezza dal punto in cui il campione di crio per SEM sarà ottenuto sul bordo tagliato dello stelo raccolto sia più lunga della lunghezza massima del recipiente del campione al fine di prevenire artefatti indotti dalla tensione all'interno del crisoample. Quindi, coprire il campione con un sacchetto di plastica nero per ridurre la traspirazione.
Mantenere l'estremità di taglio del campione nell'acqua e mantenere questa condizione per circa 30 minuti al fine di rilassare la tensione dello xilema. Successivamente, misurare nuovamente il potenziale idrico per confermare il rilassamento della tensione xilem. In primo luogo, utilizzare forbici o un coltello da utilità per tagliare e aprire un lato di un colletto a tenuta d'acqua.
Attaccare saldamente il collare attorno allo stelo con nastro adesivo tenendo l'apertura orizzontalmente. Indossare guanti isolanti e tenere in sicurezza il vaso di azoto liquido. Far funzionare azoto liquido nel collare fino a quando non è pieno e tenerlo riempito aggiungendo costantemente azoto liquido aggiuntivo per congelare completamente l'acqua nello xilem.
Dopo un tempo di congelamento sufficiente, staccare il collare dalla porzione congelata dello stelo del campione per rimuovere l'azoto liquido. Utilizzare immediatamente una sega a mano fine per raccogliere il campione. Quindi coprire il campione congelato con un pezzo di foglio di alluminio o rimetterlo in un tubo campione.
Posizionare rapidamente il campione raccolto in un contenitore pieno di azoto liquido. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per eseguire l'osservazione. Per iniziare, impostare la temperatura della camera campione del criostato a meno 30 gradi Celsius, che di solito è abbastanza fredda da mantenere la linfa xilem della maggior parte delle piante in uno stato congelato.
Utilizzare un coltello affilato o una sega a denti fini per tagliare il campione in un piccolo pezzo che può essere regolato per il supporto del campione di un crio-SEM. Montare il pezzo tagliato su un mandrino, un supporto per un criostato, con mezzo di incorporamento con congelamento dei tessuti per la criosezione. Attaccare il mandrino a un portapenne di un microtomo del criostato.
Tagliare la superficie radendo ripetutamente sezioni spesse da cinque a sette micrometri. Tagliare più di 1.000-2.000 micrometri in profondità totale alla superficie iniziale è utile per elmininare la porzione danneggiata del campione causata dal pre-taglio. Dopo aver tagliato approssimativamente una superficie del campione, regolare una porzione inutilizzata della lama del microtomo sopra la superficie del campione.
Allargare leggermente la distanza tra la superficie del campione e la lama. E tagliare la superficie solo una o due volte. Quindi, far scorrere di nuovo la lama e posizionare una porzione inutilizzata della lama sulla superficie del campione.
Ripetere questa lavorazione di taglio da tre a quattro volte per ottenere una superficie chiara senza segni di coltello. Dopo il taglio finale, impostare la posizione della lama lontano dal campione per evitare che la polvere si attacchi al campione. E stacca il mandrino dal microtomo.
Successivamente, attaccare il campione a un supporto per campioni crio-SEM con mezzo di incorporamento con congelamento dei tessuti nella camera criostatica. In primo luogo, utilizzare azoto liquido per mantenere una temperatura inferiore a meno 120 Celsius nella camera del campione crio-SEM secondo il manuale dell'utente dell'apparecchiatura. Quindi, posizionare il supporto del campione con il campione preparato in un contenitore isolante riempito con azoto liquido nella camera criostatica.
Utilizzare un campione che scambia l'asta per tenere il portamine sotto l'azoto liquido. Trasferire rapidamente il supporto del campione nella camera di pre-evacuazione della camera del campione crio-SEM non appena inizia l'evacuazione della camera di pre-evacuazione. Per iniziare, accendere la tensione di accelerazione della pistola elettrica.
Quindi, aumentare la temperatura dello stadio del campione a meno 100 gradi Celsius. Attendere alcuni minuti per rimuovere la polvere di gelo e per ridurre leggermente il livello superficiale del ghiaccio nelle cellule xileche rispetto alle pareti cellulari. Quindi, abbassare la temperatura dello stadio speiumen a meno 120 gradi Celsius.
In questo studio, i metodi di osservazione crio-SEM sono usati per visualizzare chiaramente la distribuzione dell'acqua su scala cellulare. A basso ingrandimento, l'area nera nelle immagini indica le cavità da cui l'acqua scompare completamente o parzialmente, mentre l'area grigia indica pareti cellulari xilem, citoplasma e acqua. Ad alto ingrandimento, diventa evidente che l'acqua non è completamente persa dall'apparecchio di tre tracheidi, indicando il verificarsi di macro bolle nella linfa xilem in situ.
Per quanto riguarda le specie a lati, l'occorrenza della cavitazione è facilmente individuabile all'interno dei vasi, mentre l'esistenza dell'acqua è difficile da distinguere all'interno delle fibre, specialmente a basso ingrandimento. Le cellule di citoplasma e parenchima possono essere distinte dall'acqua all'interno di tracheidi o vasi attraverso trame del piano di ghiaccio. L'analisi dell'effetto della temperatura sul processo di incisione del congelamento rivela che la polvere di gelo viene gradualmente sublimato e le membrane a fossa endotracehid diventano più chiare attraverso la progressione della sublimazione con l'aumento della temperatura.
Le particelle di polvere di gelo di grandi dimensioni rimanenti possono essere eliminate con un'ulteriore incisione del congelamento. Ma questo può essere problematico in quanto diminuisce inutilmente il livello superficiale del ghiaccio nei condotti xylem. L'alta qualità dell'osservazione si ottiene in gran parte attraverso un'accurata preparazione del campione.
La levigatura della superficie con la lama affilata del microtomo è particolarmente importante. L'insufficiente levigatura da parte di una lama usata a volte può creare una superficie ruvida simile ai segni del coltello o può creare numerose occorrenze di polvere dai tagli. Il congelamento del campione senza il rilassamento della pressione negativa della colonna d'acqua causerà l'induzione artefatta della cavitazione nei condotti xilem.
Cristalli di ghiaccio raggruppati si osservano in vasi di esemplari in cui il campione non è stato rilassato. Al contrario, non si osservano cristalli di ghiaccio raggruppati nei campioni rilassati con un potenziale idrico simile. L'applicazione della fissazione del congelamento alle piante viventi traspiranti che soffrono di siccità può indurre manufatti a base di risultati come cristalli di ghiaccio raggruppati.
Questi artefatti portano a interpretazioni errate dello stato dell'acqua nel condotto xilem. Quindi è importante prima confermare il potenziale idrico dei campioni prima della fissazione del congelamento. Sebbene questa procedura fornisca un'immagine di quale stato nel condotto xilem, un albero vivente deve essere distrutto per l'osservazione.
La combinazione di altri metodi di osservazione non invasivi come la risonanza prima o la micro-TC con l'osservazione delle immagini a livello sussidiario approfondirà la nostra comprensione della natura tra trasporto e utilizzo dell'acqua. L'osservazione dello stato dell'acqua introdotta da questo documento fornirà anche un metodo per chiarire la relazione dell'acqua che viene mescolata nelle cellule e altre risposte anatomiche allo stress abiotico o biotico. Cryo-SEM equipaggiato con spettroscopia a raggi X dispersiva di energia o sim superiore sono stati utilizzati per studiare la distribuzione degli elementi sulla superficie di un campione contenente acqua.
Combinare l'analisi elementale e questa procedura in quel frame simile può darci una profonda conoscenza del comportamento delle cellule xilem legate allo stato dell'acqua. Quando si utilizza azoto liquido per il congelamento-fissazione dei campioni in una stanza, non dimenticare di ventilare la stanza per evitare carenza di ossigeno.
