Il protocollo è stato sviluppato per la produzione di varianti di caccia a lunghezza intera su scala di basso milligrammo. Permette di produrre proteine costanti di alta qualità essenziali per i ricercatori MH. A dimostrare la procedura sarà Michael Harris, ricercatore del Curia Laboratory.
Inizia aggiungendo un grammo di polietilenimmina 25 K a un litro di acqua priva di endotossine e mescola bene. Regolare il pH a 2,0 utilizzando acido cloridrico 100 millimolari e mescolare fino a quando tutto il polietilenimmina si dissolve. Quindi regolare il pH a 7,0 utilizzando una soluzione di idrossido di sodio da 100 millimolari e far passare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micrometri.
Fare aliquote della soluzione filtrata e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Propagare le cellule HEK293 nel mezzo di crescita integrato con streptomicina penicillina in un incubatore shaker umidificato a 37 gradi Celsius, 90 RPM, 5% anidride carbonica per 18-24 ore. Un giorno prima della trasfezione, diluire le cellule ad una densità di circa 1,2 x 10 alla sesta cella di potenza per millilitro in due litri di terreno di crescita in un pallone Erlenmeyer da cinque litri e incubare per 18-24 ore.
Alla fine dell'incubazione, misurare la densità e la vitalità della cella utilizzando un contatore automatico delle celle seguendo le istruzioni del produttore. Dopo aver calcolato la quantità di polietilenimmina e plasmide necessaria per la trasfezione, diluire la polietilenimmina e il plasmide singolarmente in 100 millilitri di PBS e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, mescolare il plasmide diluito e il polietilenimmina ruotando delicatamente e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti.
Aggiungere la miscela alla coltura cellulare e mescolare ruotando delicatamente. Ora, lascia che le cellule crescano per 24 ore. Il giorno successivo, aggiungere la soluzione di butirrato di sodio a una concentrazione finale di agente anti-aggregante e anti-schiuma a due millimolari in rapporto di 1: 1, 000 volume alla coltura e incubare le cellule nell'incubatore dello shaker umidificato per 48 ore.
Dopo aver misurato la vitalità e la densità della cella, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 2.000 G per 30 minuti e conservare il pellet cellulare a meno 80 gradi Celsius prima della purificazione. Per la purificazione anti-FLAG con FPLC, imballare da 12 a 25 millilitri di resina anti-FLAG su una colonna vuota a una portata di quattro millilitri al minuto utilizzando il tampone A e regolare l'altezza dello stantuffo per rimuovere lo spazio tra l'estremità dello stantuffo e il letto di resina. Quindi, sospendere il pellet cellulare scongelato nel tampone di lisi fredda e passare la sospensione cellulare una volta attraverso un omogeneizzatore ad alto taglio a 1.000 libbre per pollice quadrato di pressione.
Utilizzando una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso compatibile, chiarire il lisato a 20.000 G per un'ora. Programma FPLC nella finestra Metodo, caricare il lisato chiarificato tramite la pompa campione e lavare la colonna con i volumi di colonna desiderati di buffer A, B, C, D e buffer di eluizione come descritto nel manoscritto di testo. Una volta terminata la corsa, analizzare 10 microlitri delle frazioni di picco utilizzando SDS-PAGE.
Combinare le frazioni di picco con la purezza desiderata e risparmiare circa 50 microlitri di eluati combinati per ulteriori analisi SDS-PAGE. Inizia a equilibrare la colonna SEC usando l'FPLC e carica l'eluato anti-FLAG tramite un superloop da 50 millilitri. Dopo aver eseguito il buffer SEC, consentire che la separazione SEC avvenga durante la notte a quattro gradi Celsius.
Confrontare il profilo di eluizione con il profilo di eluizione HTT standard per distinguere i picchi monomerici, dimeri e oligomeri di ordine superiore. Raggruppare le frazioni HTT monomeriche in base al profilo di eluizione della colonna SEC e, se lo si desidera, raggruppare separatamente le frazioni HTT oligomeriche e dimeriche di ordine superiore. Concentrare la proteina HTT aggregata utilizzando un concentratore centrifugo da 100 kilodalton a quattro gradi Celsius.
Dopo aver calcolato la concentrazione proteica, aliquote meno di 100 microlitri della proteina HTT purificata in una provetta da microcentrifuga crio-sicura. Flash congelare le aliquote utilizzando azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Eseguire tutte le analisi SEC-MALS a quattro gradi Celsius sul sistema HPLC, accoppiato con un rilevatore UV, un rilevatore di diffusione della luce multi-angolo, un rilevatore di indice di rifrazione differenziale e utilizzare 0,185 come incremento dell'indice di rifrazione per HTT.
Spurgare la pompa e i rilevatori con acqua filtrata di grado HPLC e collegare la colonna UHPLC al sistema. Equilibrare la colonna con acqua filtrata e quindi buffer SEC-MALS fino a quando tutti i segnali del rilevatore raggiungono la linea di base. Iniettare due microlitri di soluzione BSA ad una portata di 0,3 millilitri al minuto per 15 minuti per iniezione.
Esaminare la qualità dei dati, eseguire la normalizzazione, l'allineamento dei picchi e la correzione dell'ampliamento della banda in base al profilo BSA e creare un modello per le seguenti esecuzioni di esempio HTT. Scongelare rapidamente una fiala del campione FL Q23-HTT in un bagno d'acqua a temperatura ambiente usando un galleggiante. Filtrare l'HTT attraverso un filtro di rotazione da 0,1 micrometri.
Iniettare da due a quattro microlitri del campione HTT e correre per 15 minuti a quattro gradi Celsius a una portata di 0,3 millilitri al minuto. Analizza i dati cromatografici e di diffusione della luce utilizzando il software di accompagnamento e genera un grafico Zimm per determinare la massa molecolare media in peso per ciascun picco. Nel presente studio, utilizzando un processo a colonna in due fasi, è stato ottenuto più del 95% della purezza per HTT e il principale contaminante era lo chaperone Hsp70, che è stato eliminato mediante ampio lavaggio con cloruro di magnesio e ATP durante la fase di purificazione dell'affinità anti-FLAG La sovraespressione di FL HTT può provocare la frammentazione della proteina, ma FL Q23-HTT prodotto con il metodo risolto come una singola banda con il peso molecolare corretto di 350 kilodalton indica che non frammentazione.
L'analisi Western blot dopo la reazione degli anticorpi con FL Q23-HTT ha dimostrato che la proteina è stata isolata senza significativi troncamenti rilevabili, poiché non sono state osservate ulteriori bande correlate ai frammenti. La varianza della lunghezza di FL HTT poly-Q, Q23, Q48 e Q73 ha reagito come previsto nel Western blot, mostrando un segnale progressivamente più forte per l'anticorpo monoclonale MW1 diretto da poli-Q, correlato all'aumento della lunghezza Q. Tra le colonne HPLC testate, la colonna SEC ha mostrato una risoluzione sufficiente tra il monomero HTT e il dimero, in modo tale da poter distinguere le masse molari.
FL HTT purificato da SEC ha mostrato bande multiple corrispondenti agli stati di oligomerizzazione, che potrebbero essere dovuti alla presenza di diversi cerotti idrofobici che contribuiscono alla formazione di oligomeri di ordine superiore durante la migrazione all'interno del gel. L'HTT purificato ha mostrato tre bande principali su PAGE nativo blu con un peso molecolare stimato di 643, 927 e 1.070 kilodalton che probabilmente rappresentano rispettivamente le specie monomeriche, dimeriche e trimeriche di HTT. La corretta gestione dell'huntingtina purificata è essenziale per evitare di generare oligomeri di alto ordine negli aggregati solubili.
È imperativo che l'utente finale lavori rapidamente per erogare il campione in provette pre-refrigerate prima del congelamento flash. I test di stabilità a lungo termine possono essere eseguiti su campioni conservati per periodi prolungati a meno 80 gradi Celsius. Ripetute analisi HPLC SEC-MALS confermeranno se vi sono state modifiche al contenuto monomerico del campione.
