Vorremmo ringraziare il Dr. Xiaowen Yang (servizio di clonazione PROTEX) per la preparazione dei costrutti di espressione utilizzati per questo lavoro e l&#39;Università di Leicester core Biotecnologia Servizi. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio BBSRC, il Programma Fiducia Wellcome e sovvenzioni Senior Investigator WT085408 &amp; WT100237 e BBSRC concedono RM31G0224.

NOTA: Il protocollo è adatto a qualsiasi scala di espressione, quindi, i volumi e le quantità di reagenti devono essere scalati in modo proporzionale. Un adatto vettore di espressione di mammifero deve essere utilizzato per questo protocollo. Qui abbiamo utilizzato una versione modificata pcDNA 3.1 vettore di espressione che permette comodamente l&#39;inclusione o l&#39;esclusione di un tag di affinità in base alla scelta degli enzimi di restrizione utilizzati nella clonazione (Figura 1). Il seguente protocollo descrive un grande trasfezione scala. 1 Large Scale Cultura / trasfezione in 1 L Roller Bottiglie Crescere e mantenere le cellule sospensione adattato HEK293F secondo protocolli standard. Tipicamente colture starter comprese tra 30 e 100 ml sono coltivati ​​in 250 ml coniche fiasche di coltura cellulare. <ol><li> Cellule Seed a 0.5 x 10 6 cellule / ml in un volume finale di 300 ml in ogni bottiglia rullo 1 L. NOTA: bottiglie rulli ospitare un minimo di 150 ml ad un massimo di300 ml di coltura in sospensione. Per i più grandi transfezioni scala utilizzare più bottiglie. </li><li> Incubare per 24 ore in un agitatore orbitale incubatore a 37 ° C, 120 rpm, e 5% di CO 2 fino cellule raggiungono una densità di 1,0 x 10 6 cellule / ml (cellule devono dividere approssimativamente ogni 24 ore). </li><li> Pipettare un totale di 300 mg di DNA, sterilizzata per filtrazione (vedi metodo supplementare) in 30 ml di PBS e mescolare vigorosamente nel vortex per 3 secondi. NOTA: Utilizzare un totale di 1 mg di DNA per milione di cellule trasfettate. Se due o più plasmidi devono essere co-trasfettate ridurre la quantità di ciascun modo che il rapporto di DNA di cellule rimane costante. </li><li> Aggiungere 1,2 ml di 0,5 mg / ml, sterilizzata per filtrazione PEI alla soluzione PBS / DNA e vortex vigorosamente per 3 sec. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Aggiungere il DNA / PEI miscela alle cellule - che dovrebbe essere ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml (passo 1.3). </li><li> A seguito di co-trasfezione, incubare le cellulein un incubatore agitatore orbitale per un ulteriore 48 ore a 37 ° C, 120 rpm, e 5% di CO 2. </li><li> Harvest proteine ​​intracellulari mediante centrifugazione cellule a 3.000 xg per 5 min e immagazzinare il pellet a -80 ° C. NOTA: In alternativa, usare uno standard (non-CO 2) che agita incubatrice, se l&#39;atmosfera sopra la coltura viene sostituito con il 5% di CO 2 e il coperchio della bottiglia è sigillata. L&#39;atmosfera dovrà essere sostituita ad ogni passaggio (normalmente ogni 2 giorni). </li></ol> 2.-Protein complesso Purificazione da estratto cellulare totale Questo protocollo è ottimizzato per la purificazione dei complessi nucleari che utilizzano proteine ​​bandiera-tag. <ol><li> Scongelare pellet di cellule in ~ 40 ml di tampone di lisi pre-raffreddata (100 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo, 0,3% Triton X-100, inibitori della proteasi) per l di cultura. </li><li> Risospendere il pellet pipettando su e giù parecchie volte (per evitare la formazione di schiuma, non fare vortex). </li&gt; <li> Accuratamente risospendere le cellule utilizzando un omogeneizzatore di vetro. Sonicare per 3 cicli (15 sec a 15 sec, off). Centrifugare a 30.000 xg per 25 min a 4 ° C e conservare il surnatante. </li><li> Equilibrare 1,25 ml di anti-bandiera ricco di resina di agarosio per litro di coltura da lavare tre volte con tampone di equilibrazione resina (acetato di potassio 100 mM, 50 mM Tris pH 7.5). </li><li> Incubare l&#39;estratto cellulare tutto dal punto 2.3 con la resina di affinità in uno o più di 50 ml provette e ruotare delicatamente il campione per 30-120 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare a 3000 xg per 1 min a 4 ° C, il surnatante scarti. </li><li> Lavare la resina con 45 ml di tampone di pre-refrigerati 1 (100 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo, 0,3% Triton X-100). Centrifugare a 3000 xg per 1 minuto e scartare il surnatante. </li><li> Ripetere il punto 2.7 utilizzando tampone di sale (acetato di potassio 300 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo), seguito da buffer di basso contenuto di sale (acetato di potassio 50 mM, 50 mM Tris pH 7.5, 5% glicerolo) e TEV Decolleté Buffer (50 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7.5, TCEP 0,5 mM). NOTA: Assicurarsi che ogni lavaggio è breve cioè, sufficiente a pieno risospendere la resina e non più. </li><li> Raccogliere un campione di 10 ml di resina e diluire in 1 volume di 2x tampone di proteine ​​di carico per l&#39;analisi (controllo legato alle proteine). Non utilizzare agenti riducenti al fine di evitare di rilasciare l&#39;anticorpo dalla resina. </li><li> Risospendere la resina in 8-10 ml di pre-raffreddata buffer di TEV scissione e trasferimento in una provetta da centrifuga 15 ml. </li><li> Aggiungere ~ 40 mcg di TEV proteasi (da magazzino a 1 mg / ml) per L di cultura originale e mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Sostituire atmosfera tubo con il 100% di N 2 gas per prevenire l&#39;ossidazione delle proteine. </li><li> Ruotare delicatamente O / N a 4 ° C. </li><li> Centrifugare a 3000 xg per 10 min. Trasferire il surnatante in un filtro ultra centrifugo con un adeguato peso molecolare di cut-off e concentrarsifino a 500 microlitri. </li><li> Raccogliere un campione di 10 microlitri della proteina concentrato e diluire a 1 volume di tampone 2x proteina caricamento per analisi. (TEV controllo eluato). </li><li> Raccogliere un campione di 10 ml di resina e diluire a 1 volume di tampone 2x proteina caricamento per analisi. Non utilizzare agenti riducenti per evitare rilasciando grandi quantità di anticorpi dalla resina. (Controllo di resina post-TEV). </li><li> Equilibrare la colonna cromatografia ad esclusione dimensioni, con buffer di gel filtrazione (acetato di potassio 50 mM, 50 mM Tris pH 7.5, TCEP 0,5 mM). </li><li> Filtrare la proteina attraverso un filtro da 0,22 micron </li><li> Caricare il campione nella colonna e raccogliere le frazioni. </li><li> Campioni Eseguire passi da 2.9, 2.15 e 2.16 e le frazioni di filtrazione gel dal punto 2.19 su un SDS-PAGE e colorazione Coomassie per l&#39;analisi. NOTA: Si consiglia di eseguire un SDS-PAGE di campioni da gradini 2.9, 2.15 e 2.16 prima di gel filtrazione per confermare espressione della proteina bersaglio.</li>
</ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Abbiamo sviluppato un metodo efficace semplice ed economico (costa PEI molto meno disponibili in commercio reagenti di trasfezione lipofile) per esprimere e purificare grandi quantità di proteine ​​ricombinanti e complessi multi-subunità da cellule di mammifero. Trasfezione ottimale e l&#39;efficienza di espressione possono essere raggiunti se il DNA plasmidico altamente puro (260/280 tra 1,8 e 2,0) viene utilizzato in combinazione con PEI come descritto nella sezione del protocollo. Le cellule devono essere coltivate in mezzi sierica- e senza antibiotici, quindi, una tecnica sterile è strettamente necessario per passaging e le cellule trasfezione per evitare infezioni costose e che richiede tempo. La vitalità cellulare dovrebbe essere del 90% o superiore e culture non dovrebbe essere cresciuto fino a densità superiori a 2,5 x 10 6 cellule / ml immediatamente prima di un transfezione, in quanto così facendo si riduce la resa di proteine. Per la trasfezione di successo, le colture devono contenere solo le celle singole o divisione. I cluster possono essere interrotte da vigorevortex ous 20 a 30 secondi (Figura 5). Il rapporto di ciascun plasmide usato nella co-trasfezione può essere variata dall&#39;utente secondo la stechiometria dell&#39;essere complesso studiato. Espressione efficienza può essere ottimizzato per la proteina di interesse, in modo che una volta espressione adatto può essere stabilita. Purificazione deve essere eseguita mantenendo il freddo campione proteico in ogni momento a ridurre il rischio di indesiderati degradazione proteolitica. La scelta delle variabili e buffer di purificazione è critica, in quanto possono interferire con elementi strutturali o siti attivi di alcune proteine, spesso con conseguente ridotta solubilità e / o perdita di attività enzimatica. Trasfezioni piccole dimensioni sono particolarmente utili per testare diversi costrutti per la purificazione di grandi complessi proteici. Oggi, una grande varietà di metodologie alternative sono disponibili per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti eucariotiche (Tabella 2). Ad esempio, Baculovirus espressione in cellule di insetto è ampiamente utilizzato per la sua elevata efficienza di trasduzione e la sua mancanza di citotossicità in confronto ad altre specie virali 6. Tuttavia, il processo di rendere il virus è in termini di tempo e la sua instabilità non consente al virus di essere immagazzinato per lunghi periodi. D&#39;altro canto, sistemi di espressione di lievito offrono la possibilità di coltivare cellule di densità molto elevate nelle culture fermentatori, con conseguente alte rese di proteine ​​7. Ma non hanno ancora la piena varietà di modificazioni post-traduzionali necessarie per le proteine ​​eucariotiche piegare correttamente e interagire con i loro partner proteici. HDAC3, per esempio, è espresso ma non si piega in E. coli. Tuttavia, quando espresso in cellule 293F, siamo stati in grado di purificare un enzima attivo nel complesso con la sua co-repressore (SMRT) e una molecola di inositolo tetrafosfato (IP4) 8, che non si trova nelle cellule procariote. Questo metodo ci ha anche permesso di purificare e risolvere il cristallo structure di HDAC1 interagire con MTA1 nel complesso nurd, che allo stesso modo viene attivato da IP4 9. Idealmente, vorremmo sempre esprimere proteine ​​eucariotiche nel loro ambiente naturale, fisiologico. Sistemi di espressione di mammifero che impiegano cellule HEK 293-EBNA1 in bioreattori 10-12 sono stati descritti e produrre livelli molto alti di proteine, ma questi possono essere complessi da utilizzare. Il nostro metodo è una semplice e accessibile alternativa ai sistemi di espressione in batteri, lieviti e bioreattori. Il metodo di espressione è veloce e non richiede l&#39;impiego di attrezzature costose, soprattutto se l&#39;atmosfera bottiglia rullo o pallone viene sostituito con il 5% di CO 2 e vengono utilizzati incubatori stringono standard. Abbiamo usato questi protocolli di co-trasfezione più plasmidi e purificare complessi con un massimo di cinque proteine ​​con rese di&gt; 1 mg / L di cultura. È interessante notare che, il sistema aiuta l&#39;individuazione di stabili complessi ben educati. Per esempio, expressione del complesso binario di HDAC1 e Sin3A ha rese limitate di proteine, ma l&#39;aggiunta di SDS3 portato a 5 volte maggiori quantità e quindi guida il biologo strutturale nella scelta dei costrutti adatti e complessi stabili per la cristallizzazione.

Il rapido progresso della biologia cellulare molecolare e la costante necessità di farmaci migliorati in medicina ha creato la necessità per i biologi strutturali a guardare strutture proteiche sempre più complesse. Questi spesso possono richiedere particolari modificazioni post-traduzionali, chaperon molecolari e co-fattori per sostenere il loro ripiegamento elaborato e l&#39;attività enzimatica. Mentre la stragrande maggioranza delle strutture presenti nel Protein Data Bank sono stati ottenuti utilizzando sistemi di espressione batterici, procarioti sono in grado di eseguire un gran numero di queste modifiche e mancano molti cofattori essenziali eucariotiche. Questo può essere un problema per lo studio di grandi complessi multi-subunità che vengono attivati ​​da piccole molecole di segnalazione, nonché per nucleare, superficie cellulare e proteine ​​secrete che richiedono elaborati macchinari pieghevoli. Un certo numero di E. coli sono stati progettati per superare alcune di queste limitazioni 1. Negli ultimi anni, tuttavia, l&#39;uso di msistemi di espressione ammalian è in aumento perché affidabile producono proteine ​​eucariotiche che sono altrimenti problematici per esprimere in altri sistemi 2. Oggi è possibile ottenere linee cellulari di espressione di mammifero stabili e transienti attraverso una varietà di tecniche che vanno dalla trasduzione virale di transfezione mediata chimica, fisica trasferimento genico come elettroporazione e iniezione diretta 3. Mentre tutti questi metodi hanno la loro propria serie di vantaggi e svantaggi, solo pochi di loro sono adatti per studi strutturali che sono troppo costosi e / o di tempo. Qui si descrive un metodo molto semplice, veloce, poco costoso ma molto efficace per esprimere complessi proteici per la biologia strutturale in sospensione coltivato cellule di mammifero. L&#39;approccio utilizza transitorio co-trasfezione di un embrionali umane di rene (HEK) linea cellulare (ad esempio, le cellule HEK Freestyle 293F). Queste cellule sono state derivate dalla HEK 293 cell linea, sono adattate a crescere in colture in sospensione, raggiungendo elevate densità utilizzando mezzi privi di siero (come FreeStyle 293 Expression Media). Le cellule sono poi trasfettate utilizzando una versione derivata di polietilenimmina (PEI), un reagente polimerico economico che è stato segnalato per funzionare per una vasta gamma di cellule di mammifero 4 formando complessi DNA / PEI che entrano nella cellula ospite per endocitosi 5. Questo metodo è adatto sia su piccola scala (30 ml) e su larga scala (fino a 300 ml) esperimenti e in grado di produrre alti livelli di complessi proteici purificati. È particolarmente utile per studiare le proteine ​​che richiedono macchinari complessi pieghevoli, cofattori o particolari modificazioni post-traduzionali che non possono essere eseguite da batteri, lieviti e cellule di insetto. In questo protocollo presentiamo l&#39;espressione e purificazione della tre-proteina scaffold centrale dal complesso di repressione trascrizionale Sin3A. Si tratta di HistoneDeacetilasi 1 (HDAC1), soppressore di difettoso Silencing 3 (SDS3) e Switch-indipendente 3 (Sin3A). Il complesso purificato viene utilizzato per prove di cristallizzazione high-throughput.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

Qui vi mostriamo un 2 L (8 x 250 ml culture) transitoria co-trasfezione e purificazione della HDAC1, SDS3, Sin3A complesso ternario. HDAC1 e SDS3 interagiscono con Sin3A attraverso il dominio HDAC-interazione (HID) di Sin3A. Un tipico rendimenti di depurazione fino a 1 mg di complesso per litro di coltura. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Schema del pcDNA 3.1 vettore di espressione modificato. Il plasmide è stato digerito con EcoRV e EcoRI per includere l&#39;affinità-tag e il sito scissione TEV sul terminale amino di Sin3A. Per clonare le versioni senza tag di HDAC1 e SDS3, il vettore è stato digerito con EcoRI e KpnI. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 SDS-PAGE mostra la prima fase della purificazione. La corsia &quot;proteina legata&quot; indica il complesso legato alla resina di affinità. Dopo TEV digestione, l&#39;etichetta presente sul Sin3A-HID viene scissa spento e il complesso viene eluito dalla resina, come mostrato nella seconda e terza corsie del gel. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Cromatogramma della purificato mediante cromatografia di esclusione dimensione proteina-complesso. Notare che il complesso puro diluito in volume vuoto perché forma un dimero in soluzione. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. SDS-PAGE mostra le frazioni del gel filtrazione mostrato in Figura 3. Figura 5 Trypan Blue-macchiato cellule HEK 293F a 2.3x10 6 cellule / ml pronto per essere transfettate. Cellule devono essere presenti come cellule singole o divisione solo, mentre il cluster di grandi dimensioni possono essere suddivisi nel vortex vigorosa per circa 25 sec. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Possibili cause </td><td> Azione </td></tr><tr><td rowspan="4"> Bassa resa di proteine. </td><td> Basso numero di cellule transfettate. </td><td> Assicurarsi densità cellulare è di circa 1.0 x 10 6 prima di aggiungere la miscela di reazione trasfezione alla cultura. </td></tr><tr><td> Le cellule possono essere stati reinoculate troppe volte. </td><td> Utilizzare le cellule ceppo dopo circa 90 passaggioetà. </td></tr><tr><td> DNA può essere rallentata o hanno una quantità elevata di impurità. </td><td> Assicurarsi che il DNA plasmidico utilizzato ha un rapporto di 260/280 tra 1,8 e 2,0. Esecuzione del DNA su un gel di agarosio è consigliabile valutare la qualità. </td></tr><tr><td> Protein (s) espressi non sono stabili o abbastanza solubile. </td><td> Prova diversi costrutti in piccola scala prima di up-scalare le trasfezioni. Assicurarsi che i tag non interferiscono con la struttura della proteina (s) di interesse. </td></tr><tr><td> Cellule guardare nuvoloso e hanno un colore e / o odore insolito. </td><td> Le cellule sono infette da batteri o lieviti. </td><td> Buona tecnica sterile deve essere utilizzato in ogni momento. Fumigazione le cappe a flusso laminare e UV-disinfezione della camera di coltura cellulare in caso di infezione aiuta contenente il problema. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le cellule hanno una bassa redditività. </td><td> PH errato nei media. </td><td> Assicurarsi che le culture sono coltivate al 5-8% di CO 2in ogni momento. </td></tr><tr><td> Le cellule sono state coltivate fino ad una densità sopra 3.0x10 6 cellule / ml. </td><td> Le cellule non devono essere coltivate fino a densità superiore a 2,5 x 10 6 cellule / ml subito prima di un trasfezione e mai superiori a 3,0 x 10 6 cellule / ml. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Purificazione per affinità non ha funzionato </td><td> Protein (s) non viene espresso. </td><td> Vedi sopra. </td></tr><tr><td> Condizioni di depurazione potrebbe essere sbagliato. </td><td> Regolare le condizioni di buffer (ad esempio, sale alto, basso contenuto di sale, il pH.) </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Risoluzione dei problemi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sistema </td><td> Vantaggi </td><td> Svantaggi </td></tr><tr><td> E. coli </td><td><ul><li> Velocesistema di espressione </li><li> Rendimenti elevati di proteine </li><li> Poco costoso </li><li> Adatto per la produzione conveniente di proteine ​​marcati con isotopi </li></ul></td><td><ul><li> La mancanza di accompagnatori importanti che può essere richiesto per il ripiegamento delle proteine </li><li> La mancanza di molte modificazioni post traduzionali </li><li> Può mancare di co-fattori che sono importanti per la funzione delle proteine ​​e / o montaggio complesso. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Impossibile eseguire la maggior parte dei post-traduzionali </li><li> Poco costoso </li></ul></td><td><ul><li> Mancano alcune modificazioni post-traduzionali </li><li> Può mancare di co-fattori che sono importanti per la funzione delle proteine ​​e / o montaggio complesso. </li></ul></td></tr><tr><td> Espressione di Baculovirus in cellule di insetto </td><td><ul><li> Può eseguire tutte le modificazioni post traduzionali &lt;/ Li&gt; <li> Baculovirus è meno citotossico di altri ceppi virali </li></ul></td><td><ul><li> Preparazione del virus per la trasduzione è tempo </li><li> Il virus non è stabile e non può essere immagazzinata per lunghi periodi di tempo </li><li> Cellule di insetto possono mancare co-fattori che sono importanti per la funzione delle proteine ​​e / o montaggio complesso. </li></ul></td></tr><tr><td> Bioreattori con sistemi di mammiferi </td><td><ul><li> Può eseguire tutte le modificazioni post traduzionali </li><li> Può fornire tutti i co-fattori necessari per la funzione delle proteine ​​e assemblaggio complesso </li><li> Can cellule di coltura a densità molto elevate </li><li> Può esprimere tutte le proteine ​​di mammiferi che richiedono macchinari complessi pieghevoli </li><li> Rendimenti molto elevati di proteine </li></ul></td><td><ul><li> Richiede personale specializzato per utilizzare il bioreattore. </li><li> È necessario costose attrezzature. </li><li> Ottimizzazione condizione di espressiones può richiedere molto tempo. </li></ul></td></tr><tr><td> Cellule in sospensione HEK 293F </td><td><ul><li> Può eseguire tutte le modificazioni post traduzionali </li><li> Può fornire tutti i co-fattori necessari per la funzione delle proteine ​​e assemblaggio complesso </li><li> Può esprimere tutte le proteine ​​di mammiferi che necessitano di macchine di piegatura complesso </li><li> Protocollo veloce e intuitivo trasfezione </li><li> Relativamente poco costoso rispetto ai bioreattori e / o altri reagenti di trasfezione disponibili in commercio. </li></ul></td><td><ul><li> Anche se a prezzi accessibili, non economico come espressione nei batteri </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Vantaggi e svantaggi dei principali sistemi di espressione.

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Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

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53.3K Views.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Un metodo per la produzione di proteine ​​ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

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Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...