Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalle sovvenzioni K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) e P01GM107012 (KWM) dal National Institutes of Health, e da fondi del Roy J. Carver Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Biologia Molecolare presso la Iowa State University . Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIH.

Questo protocollo è sufficiente per l&#39;espressione utilizzando HEK293F o cellule HEK293S. 1. Istituzione cellulare <ol><li> Cultura Inoculazione Nota: Tutte le procedure di coltura di manipolazione devono essere effettuate in una struttura BSL-2 ed ogni articolo portato nel cabinet biosicurezza devono essere sterilizzati a spruzzo con etanolo al 70% in soluzione acquosa. <ol><li> Azionare l&#39;agitatore incubatore a 135 giri al minuto, l&#39;80% di umidità e al 8,0% di CO 2 e 37 ° C. Turn &quot;on&quot; la lampada UV del cabinet biosicurezza, almeno 1 ora prima di lavorare. Preriscaldare le bottiglie sigillate Piano A e Piano B in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Sterilizzare 125 ml palloni crescita Erlenmeyer con tappo ventilato, pipette, pipette, e le bottiglie media preriscaldate a spruzzo con l&#39;etanolo al 70% in soluzione acquosa. Posizionare questi elementi nell&#39;armadio biosicurezza. Nota: Sterilizzare solo la plastica rivestimento esterno 125 ml Erlenmeyer pallone di coltura, e quindi rimuovere solo quando is all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. </li><li> Per una cultura 30 ml, prelevare 26 ml di terreno A e 3 mL di terreno B (10% della coltura finale) e trasferire nel pallone 125 ml coltura Erlenmeyer e delicatamente mescolare agitando (qui di seguito definito come terreno di coltura fresco). </li><li> Trasferimento una fiala di cellule contenenti cellule HEK293F, congelati a -80 ° C, sul ghiaccio e passare alla stanza cultura. Nota: cellule HEK293F sono forniti ad una densità di 1 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Riscaldare leggermente il flaconcino in bagno d&#39;acqua a 37 ° C per scongelare parzialmente le cellule (ca. un min e cellule non deve essere completamente scongelato). Sterilizzare l&#39;esterno del flaconcino con la etanolo al 70% in soluzione acquosa e spostarlo nel cabinet biosicurezza. </li><li> Utilizzando 1 ml pipetta, ritirare la sospensione cellulare (circa 0,7 ml) e trasferire nella beuta da 125 ml contenente 29 ml di terreno di coltura fresco. Chiudere il coperchio del pallone di coltura e spostarlo nello shaker incubate. </li></ol&gt; </li><li> Manutenzione delle cellule: Controllare densità cellulare, vitalità e Passages cellulari <ol><li> Controllare la densità delle cellule dopo 24 ore di scongelamento della cultura seguendo il protocollo di seguito. Nota: le cellule sono coltivate per 24 ore dopo lo scongelamento per assicurare la crescita delle cellule essenziali e la vitalità di&gt; 80%. </li><li> Sterilizzare il pallone di coltura con etanolo al 70% in soluzione acquosa e spostarla nella biosicurezza. </li><li> Con una pipetta 1 ml e pipetta, ritirare lentamente 100 ml di coltura in sospensione e trasferimento in una sterile ml eppendorf tubo 0.5. Chiudere e trasferire il pallone di coltura di nuovo nel shaker appena possibile. </li><li> Mescolare 7,5 ml di una soluzione Trypan Blue con 7,5 ml di cellule. Mescolare energicamente con 7,5 ml di / miscela blue Trypan cellulare e trasferirlo alla slitta conteggio. </li><li> Accendere il contaglobuli automatico e posizionare il vetrino di conteggio nella camera di caricamento. Il lettore automatico viene attivata e le cellule vengono contate automaticamente nelle unitàdel numero di cellule per ml redditività e cento </li><li> Determinare il volume della coltura donatore richiesta per il trasferimento di un mezzo di coltura fresco ad una densità di cellule 0,3 x 10 6 cellule / ml in diretta. Nota: vedere un esempio di calcolo in materiali supplementari. </li><li> Ripetere i punti 1.1.2 e 1.1.3 del protocollo &quot;1,1 Cultura Inoculazione&quot; di cui sopra per preparare materiali necessari per terreno di coltura fresco. </li><li> Trasferire medio A (23 ml) e medio B (3 ml) ad una beuta da 125 ml di coltura fresco. Rimuovere le boccette di medio A e B Media dal cabinet biosicurezza. Nota: Gli stock di bottiglie di media, non devono essere conservati nell&#39;armadio biosicurezza allo stesso tempo come le cellule HEK 293F. Ciò limita la possibilità di contaminazione delle bottiglie stock medi. </li><li> Rimuovere la coltura cellulare HEK293 dall&#39;incubatore e spruzzo con etanolo al 70% in soluzione acquosa. Usando una nuova pipetta, ritirare l&#39;aliquota di cellule (4 ml, questo volume è stato determinato in funzione to passo 1.2.6) dalla cultura e trasferirlo nel pallone contenente terreno di coltura fresco. </li><li> Trasferire entrambe le culture dal cabinet biosicurezza sul dispositivo agitatore incubatore impostato in base al 1.1.1. Crescere le cellule ad una densità approssimativa di 2-3 x 10 6 cellule / ml in diretta. Nota: Il tempo approssimativo raddoppio delle cellule è di 32 ore. Ci vorranno 3-4 giorni per raggiungere questa densità. Incubare le cellule per 3-4 passaggi di avere stabile modello di crescita delle cellule prima del primo trasfezione. </li></ol></li></ol> 2. Preparare Materiali per Trasfezione <ol><li> Preparazione Cellule HEK293 (1 ° giorno) <ol><li> Cellule sottocolture ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in acqua dolce Piano B 24 h prima della transfezione secondo punto 1.2. Nota: il volume della coltura trasfezione sarà dipendente dal numero di cellule. Volumi trasfezione più grande (&gt; 20 ml) richiederanno un maggior volume di cultura in questa fase. </li></ol></li><li> Preparazione Stgreggi di Materiali <ol><li> Preparare soluzione stock di polyethylenimine lineare (PEI) ad una concentrazione di 1 mg / ml in un tampone contenente 25 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) e NaCl 150 mM (pH 7,5). Sciogliere completamente PEI; questo potrebbe richiedere 30-60 minuti a temperatura ambiente. Sterilizzare attraverso 0,22 micron filtro per siringa e conservare a -20 ° C per un uso a lungo termine. </li><li> Preparare sterili DNA plasmidico (come indicato ai punti 2.2.2.1-2.2.2.4). La procedura di costruzione plasmide è descritto altrove 42. Una breve procedura per la preparazione del DNA è spiegato qui: <ol><li> Grow una coltura di cellule di Escherichia coli chimicamente competenti trasformate con il vettore pGEn2 in 1 L di terreno LB (Tryptone- 10 g / L, lievito Estratto di 5 g / L e cloruri di sodio 10 g / L) supplementato con 100 mg / ml ampicillina. E. coli è cresciuto a 37 ° C in un non-umidificato, scuotendo incubatrice. </li><li> Purificare il DNA pGEn2 codifica vettore obiettivo plasmide secondo la manuprotocollo di purificazione del DNA del costruttore. </li><li> Per garantire la completa sterilità del DNA plasmide, effettuare le isopropanolo precipitazioni e risospensione fasi finali delle procedure di estrazione del DNA all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. </li><li> Aggiungere il volume di isopropanolo (indicato nel kit miniprep) al DNA eluito e centrifugare a 10.000 x g per 10 min. Sterilizzare l&#39;esterno del contenitore DNA con etanolo al 70% in soluzione di acqua e trasferirla all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. Eliminare il surnatante isopropanolo con una pipetta e aria asciugare il pellet di DNA. Una volta asciutto, risospendere il pellet in sterile tampone Tris 10 mM, pH 8,0. </li></ol></li><li> Preparare soluzione stock di 220 valproico mm (VPA) Acido in acqua e sterilizzare in passaggio attraverso un filtro sterile 0,22 micron. Conservare la soluzione a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li></ol> 3. Stabilire una trasfezione transiente <ol><li> Transfection (giorno 0) <ol><li> Controllare la densità cellulare, seguendo i punti 1.2.2 tramite 1.2.5 di &quot;1.2. Manutenzione delle cellule&quot; di cui sopra. Determinare la quantità di cellule per trasfezione (2,5-3,0 x 10 6 cellule / ml in diretta con la vitalità&gt; 95%). Vedere un esempio di calcolo in materiali supplementari. </li><li> Trasferire il volume delle cellule di coltura di sospensione calcolati nel passaggio precedente (qui 67 ml) in una provetta da centrifuga da 250 ml con una pipetta sierologica sterile. Raccogliere le cellule per centrifugazione per 5 min a 100 x g. </li><li> Nel frattempo, preparare un terreno di coltura fresco trasfezione seguente passo 1.1.3 secondo &quot;1.1. Culture inoculazione&quot; di cui sopra. Vedere i materiali di complemento per un esempio di calcolo. Inoltre, il trasferimento 5 ml di terreno di coltura fresco per una provetta sterile da 15 ml e mettere da parte. </li><li> Tubi di trasferimento contenente le cellule pellet nel biosicurezza dopo sterilizzazione all&#39;esterno dei tubi con etanolo al 70% in soluzione acquosa e utilizzare una pipetta sterile per decantare the surnatante costituito da terreno di coltura trascorso. </li><li> Vigorosamente risospendere le cellule pellet pipettando su e giù con 10 ml di terreno di coltura fresco e trasferimento al pallone con terreno di coltura fresco trasfezione (preparato nel passaggio 3.1.3). Avvitare il tappo sul pallone di coltura di cellule ventilati e spostare il pallone incubatore (come indicato in 1.1.1) per 15 minuti-1 ora con agitazione. </li><li> Durante questo tempo, diluire il DNA plasmidico e scorte PEI utilizzando terreno di coltura fresco (utilizzando il volume 5 ml prelevato dal passo 3.1.3) ad una concentrazione finale di 0,5 mg / mL. Vedere i calcoli di esempio in materiali supplementari per determinare la quantità di DNA e PEI. Trasferire il pallone di coltura con le cellule disperse nel cabinet biosicurezza. </li><li> Aggiungere plasmide DNA (300 ml di 0,5 mg / mL) alla cultura utilizzando micro-pipetta e mescolare agitando delicatamente manuale. Aggiungere PEI (900 ml di 0,5 mg / mL) alla cultura, mescolare delicatamente agitando. Aggiungere 3,8 ml di cul frescomedio ture, dal punto 3.1.3, sopra e pallone trasferimento agitatore incubatore per 24 ore. </li><li> Pulire il cabinet biosicurezza in base al punto 1.1. </li></ol></li><li> Diluizione (giorno 1) (Per un volume trasfezione 50 ml) <ol><li> Incubare la cultura transfettate per 24 ore. </li><li> Prelevare 1 ml di preriscaldata 220 mm Acido valproico (VPA, preparato secondo al punto 2.2.3.) Con una sterile da 1 ml pipetta sierologica e trasferirlo in una provetta sterile da 50 ml. </li><li> Prelevare 5,0 ml di preriscaldata medio B e 44 ml di medium A preriscaldata ed aggiungere alla soluzione VPA usando una pipetta sierologica sterile per preparare 50 ml di terreno di coltura fresco con una concentrazione finale di 4,4 mM di VPA. </li><li> Spostare cultura transfettati nell&#39;armadio biosicurezza dopo la sterilizzazione l&#39;esterno del pallone con un etanolo al 70% in soluzione acquosa, aggiungere il medium di diluizione preparata e trasferire la fiaschetta al shaker incubata. </li></ol></li><li> Espressione e Harvest (Giorni 2-6) <ol><li> Incubare le cellule per altri 4-5 giorni (5-6 giorni totali da trasfezione). </li><li> Ritirare aliquote di terreno di coltura seguito passo 1.2.2. a 1.2.5. descritto in &quot;1.2. Manutenzione delle cellule,&quot; al di sopra utilizzando una sterile da 1 ml pipetta sierologica, per monitorare le cellule vitalità e salvare aliquote per analizzare l&#39;espressione di proteine ​​ad ogni giorno mediante SDS-PAGE (vedi sezione 5, sotto). </li><li> Celle di raccolta dopo 5-6 giorni di centrifugazione le cellule più medium a 1.000 g per 5 min. Inoltre, raccogliere il surnatante se la vitalità delle cellule scende al di sotto del 50% (vedere i passi 1.2.2-1.2.5). </li><li> Eliminare il surnatante che conterrà proteina secreta. Aggiungere 5 ml di candeggina al 10% al pellet di cellule HEK e scartare come un rischio biologico. </li></ol></li></ol> 4. purificazione delle proteine <ol><li> Preparare una colonna con 5 ml di proteina A sefarosio-. Equilibrare la colonna con 5 volumi di colonna di tampone A (20 mM di 3- (N-morfolino) propansolfonico (MOPS acido), pH 7,4, 100 mM NaCl). </li><li> Centrifugare il surnatante raccolto con proteina espressa ad alta velocità (14.000 g per 10 minuti) per rimuovere i detriti rimanenti. Raccogliere per decantazione in una nuova provetta. Eliminare il pellet come un rischio biologico. </li><li> Raccogliere un&#39;aliquota 10 ml del surnatante e inoltre raccogliere un piccolo campione ad ogni passo purificazione della proteina di analizzare il campione mediante SDS-PAGE (descritto nella Sezione 5). Caricare il surnatante chiarificato e raccogliere il flusso attraverso. </li><li> Lavare la colonna con 3 volumi di tampone A colonna ed eluire la proteina con volumi 5-colonna di glicina 100 mM, pH 3,0. Raccogliere l&#39;eluato in provette contenenti metà volume di 1 M tampone TRIS, pH di 8,0 per neutralizzare rapidamente il pH. </li><li> Lavare la colonna con 10 volumi di colonna di tampone A e conservare per uso futuro. </li><li> Buffer scambiare la proteina eluita con almeno un eccesso di 10 volte di tampone A con 10 kDa peso molecolare di cut-off filtri centrifughi. Nota: non concentrare il campione eluito aun volume molto basso (&lt;2 ml) nel tampone eluito. Utilizza i filtri centrifughi per scambiare il buffer con tampone A. </li><li> Conservare purificato la proteina a 4 ° C fino all&#39;utilizzo successivo. Nota: proteina espressa nel supernatante può essere purificato mediante colonne di affinità selezionati sulla base di proprietà della proteina o l&#39;uso di tag di affinità. Per una tipica procedura di purificazione, Proteina Una colonna può essere utilizzato per i frammenti Fc di IgG o colonna o nichel può essere utilizzato per le proteine ​​espresse con un tag di poli-istidina. Qui, è una descrizione delle fasi di purificazione per IgG1-Fc utilizzando una colonna di Proteina A. </li></ol> 5. Analisi di proteine ​​mediante SDS-PAGE <ol><li> Diluire le aliquote (7,5 mL) di ciascun campione con un volume uguale di tampone 2x carico (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-mercaptoetanolo, 20% glicerolo, e 0,01% blu di bromofenolo). </li><li> Far bollire la miscela a 90 ° C per 5 minuti utilizzando un blocco di calore o bagnomaria. Centrifugare i campioni a 10.000 g for 1 min. Caricare il gel preparata con 5 ml di proteine ​​marcatore e 14 ml di campioni per le analisi con una pipetta 20 microlitri con una punta monouso. </li><li> Eseguire un gel a 25 milliampere per 60 min. Terminata la fase di elettroforesi è completa, il gel in un contenitore con 1 L di acqua e microonde per 5 min. </li><li> Macchia il gel con soluzione colorante (40% etanolo, acido acetico 10% e 0,1% Coomassie blue brillante) per 2 ore e Decolorare in acqua. </li></ol> 6. glicani Analisi per spettrometria di massa <ol><li> Analizzare glicani come descritto in precedenza 44. In breve, 75 mg di IgG1-Fc è stato tripsinizzate, poi trattato dal PNGaseF per la liberazione di glicani 45. Glicani rilasciati sono stati permethylated e analizzati utilizzando laser-desorbimento di ionizzazione spettrometria assistita dalla matrice a tempo di volo di massa (MALDI-TOFMS). </li></ol> 7. Adeguamenti protocollo per scenari speciali <ol><li> Etichettatura proteine ​​con 15 N-etichettati Aminoacidi (per un volume trasfezione 50 ml) <ol><li> Erogare 5 mg di ciascun amminoacido in un singolo flaconcino di vetro sterili. Risospendere con 4 ml di acqua in autoclave (nota Tyr non completamente solubilizzare, a differenza di Lys e fenilalanina). Sterilizzare la soluzione in autoclave a 121 ° C per 15 min. Lasciare che la soluzione per raffreddare approssimativamente a 50-60 ° C. </li><li> Per un volume trasfezione 50 ml, seguire passo 3.1.3 secondo &quot;3.1 Stabilire una trasfezione transiente&quot;. Vedere la sezione Materiali supplementari per un esempio con volumi adeguati. </li><li> Per la trasfezione, seguire i passi di &quot;3. Stabilire una trasfezione transiente&quot; utilizzando terreno di coltura fresco sostituito con residui di amminoacidi etichettati come preparato in precedenza. </li><li> Dopo 24 ore di trasfezione, il giorno della diluizione coltura, prelevare 5,0 ml di preriscaldata Piano B, 40 ml di medium A preriscaldata e un fresco autoclavato 4 ml aliquota della miscela di aminoacidi (preparata come al punto 7.1.1. Sopra) e aggiungere 1ml preriscaldata soluzione madre di soluzione VPA per preparare 50 ml di terreno di coltura fresco diluizione con una concentrazione finale di 4,4 mm di VPA. Aggiungere questo mezzo per la coltura trasfezione usando una pipetta sierologica sterile. </li><li> Trasferire la cultura transfettati nell&#39;armadio biosicurezza dopo la sterilizzazione l&#39;esterno del pallone con un etanolo al 70% in soluzione acquosa, aggiungere il medium di diluizione preparata e trasferire la fiaschetta al shaker incubata. Nota: Media A è un mezzo privo di siero chimica definita. Così, è possibile preparare una formulazione diversa. Contattare il fornitore per ottenere un costume Media Una preparazione che manca di alcuni aminoacidi. E &#39;possibile avere tutti gli amminoacidi lasciati fuori, però, preferiamo utilizzare mezzo che mancano solo pochi selezionati residui perché un mezzo di abbandono completo sarebbe necessario un aggiustamento di osmolarità dopo l&#39;integrazione. Abbiamo scelto un mezzo di dropout Lys-Tyr-Phe che può essere integrata e non richiede regolazioni osmolarità. Furthermore, Medium Un fornitore non condividere liberamente le concentrazioni dei componenti di media; abbiamo usato 100 mg / l per ogni Lys, Tyr e fenilalanina con successo. I volumi del mezzo transfezione ed espressione devono essere adattati per tener conto delle aggiunte aminoacidi. Qui ci sono le modifiche al protocollo di cui sopra per l&#39;etichettatura degli isotopi </li></ol></li><li> Integrare il Trasfezione con una piccola molecola <ol><li> Preparare 100 soluzione madre mM di 2-deossi-2-fluoro-l-fucosio utilizzando acqua in autoclave e sterilizzare questa soluzione con un filtro da 0,22 micron. </li><li> Per una cultura 50 ml, aggiungere 125 microlitri (a 250 pM) della soluzione fucosio analogico al trasfezione e diluizione media. Nota: abbiamo trascurato di compiere un ulteriore regolazione del volume, perché l&#39;aggiunta del sostituente in questa concentrazione conti solo il 0,25% del totale del volume .It cultura è possibile modificare l&#39;espressione con piccole molecole inibitrici della lavorazione glicano. Qui si descrivono le condizioni di cui 2-deoxy-2-fluoro-l-fucosio, un inibitore di fucosilazione glycan. Abbiamo trovato&gt; 90% di riduzione fucosilazione aggiungendo analogico fucosio ad una concentrazione di 250 mM di trasfezione e diluizione media. </li></ol></li></ol>

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Questo protocollo illustra l&#39;espressione della proteina tramite la trasfezione transiente di cellule HEK293F o S. Le condizioni ottimali di trasfezione stabilite nei laboratori Barb e Moremen utilizzano una combinazione critica di concentrazioni di densità delle cellule e reagenti per ottenere un&#39;elevata efficienza di trasfezione. Considerazioni critiche in sede di attuazione di questo protocollo sono: il mantenimento di una cultura stabile prima di trasfezione (con la cultura coerente tempi raddoppio); trasfez...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Produrre rese elevate di proteine ​​umane opportunamente piegati e post-traduzionali modificati per l&#39;analisi dettagliata della struttura e della funzione rimane una sfida significativa. Un gran numero di sistemi di espressione sono disponibili che producono proteine ​​ricombinanti con funzione e il comportamento di tipo nativo. Sistemi di espressione batterici, prevalentemente ceppi Escherichia coli, rappresentano gli strumenti più accessibili e più comunemente utilizzati in ambito di ricerca, grazie alla semplicità di questi sistemi di espressione, però lieviti, piante, insetti e mammiferi sono anche descritti 1-4. Tuttavia, la maggior parte di questi sistemi sono incapaci di appropriate modificazione post-traduzionale di proteine ​​bersaglio. Un interesse fondamentale dei laboratori Barb e Moremen sta producendo proteine ​​eucariotiche con un&#39;adeguata glicosilazione. Molte proteine ​​umane richiedono glicosilazione appropriato per il corretto funzionamento (vedi punto 5). Il eucarioticamacchine glicosilazione è ampia e in grado di fare una vasta gamma di modifiche, tra cui sia asparagina (N) - e serina / treonina (O) linked glicani complessi 6. Si stima che&gt; 50% di proteine ​​umane sono N-glicosilata 7. Glicani sono componenti essenziali di molte proteine, tra cui gli anticorpi monoclonali terapeutici, eritropoietina, e fattori di coagulazione del sangue come fattore IX, per citarne alcuni. Anche se esistono diversi metodi per preparare adeguatamente le proteine ​​N-glicosilata e vanno dal puramente sintetica 8-10, a chemoenzimatica 11-14 o il recupero dai sistemi ricombinanti ingegnerizzati 15-20, non a caso, sistemi di espressione umane hanno finora dimostrato di essere il più robusto metodi per generare proteine ​​umane. Molti glicoproteine ​​umani terapeutiche sono prodotte in sistemi ricombinanti utilizzando cellule di mammifero. Sistemi di nota sono l&#39;ovaio di criceto cinese (CHO), mouse mieloma (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), embrionale umano Rene (HEK-293) e linee di cellule retiniche umane che sono impiegati in adesione o la sospensione di coltura per la produzione di proteine ​​4,21,22. Tuttavia, sistemi di espressione di proteine ​​di mammifero hanno richiesto la generazione di linee cellulari stabili, terreni di crescita costosi e substrato assistita procedure di trasfezione 23. Trasfezione di cellule di mammifero è realizzato con l&#39;ausilio di numerosi agenti, tra cui fosfati di calcio 24,25, polimeri cationici (DEAE-destrano, polibrene, polilisina, polyethylimine (PEI)) o caricati positivamente liposomi cationici 26-29. PEI è un policationico, carica, lineare o ramificato polimero (25 kDa) 26 che forma un complesso stabile con il DNA ed è endocitosi. Dopo acidificazione del endosome, PEI è pensato a gonfiarsi, portando alla rottura di endosomi e liberazione del DNA nel citoplasma 26,30. Fino a poco tempo, trasfezione transiente in suspensisulla cultura è stata effettuata previo formazione del complesso DNA / PEI seguita tramite aggiunta alla coltura cellulare 29. Tuttavia, Würm e collaboratori hanno riportato un protocollo altamente efficiente ottimizzato per la produzione di proteine ​​ricombinanti in cellule HEK293 che formavano un complesso DNA / PEI in situ 31,32. Ciò ha evitato preparazione, sterilizzazione del complesso, e scambio di tamponi in un terreno di coltura. Ulteriore ottimizzazione includendo plasmidi di espressione di miglioramento ha portato ad aumenti di rendimento significativo 33. Qui è un metodo che si basa su questi progressi ed è ampiamente applicabile. Condizioni di espressione può anche essere modificati per influenzare la composizione N-glicani. La linea cellulare HEK293S, con una delezione del gene che blocca trasformazione di N-glicani in una fase intermedia, porta alla espressione di proteine ​​con uniformi N-glicani composto da 2 residui N-acetilglucosamina più cinque residui di mannosio (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Queste cellulemanca la transferasi N-acetylglucosaminyl I (GntI) gene che è richiesto per N-glicani lavorazione a valle 36,37. L&#39;uso di inibitori glicosiltransferasi compreso kifunensine, analoghi di acido sialico e fucosio analogico e 2-deossi-2-fluoro-fucosio ha effetti simili e limiti di lavorazione N-glicani 38-41. Il protocollo qui riportato utilizza il vettore pGEn2 come mostrato in Figura 1 42,43, PEI assistito trasfezione transiente in cellule di mammifero (linee HEK293F o cellule HEK293S), e il recupero di alte rese di proteine ​​opportunamente glicosilata. Questo sistema è robusto e può ospitare diversi fattori tra cui marcatura isotopica e l&#39;ingegneria glycan per la produzione di grandi titoli di proteine ​​ricombinanti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

L&#39;arte di produrre proteine ​​ricombinanti con complesse modificazioni post-traslazionali rappresenta una sfida importante per gli studi di struttura e funzione. L&#39;istituzione rapida ed elevata recupero da linee cellulari di mammiferi transiente transfettate indirizzi questa barriera ed è un mezzo efficace per esprimere le proteine ​​che sono naturalmente incanalati attraverso l&#39;ER e Golgi-mediata via secretoria. Qui è un protocollo per l&#39;espressione della proteina con il HEK293F umano e linee cellulari HEK293S transfettate con un vettore di espressione di mammifero progettato per rese elevate di proteine. L&#39;applicabilità di questo sistema è dimostrata utilizzando tre glicoproteine ​​rappresentative che hanno espresso con rese tra 95-120 mg di proteina purificata recuperato per litro di cultura. Queste proteine ​​sono la FcγRIIIa umana e sialyltransferase α2-6 ratto, ST6GalI, sia espressa con una fusione GFP N-terminale, così come la immunoglobulina umana non modificato G1 Fc. Questo robusto sistema utilizes un mezzo privo di siero che è adattabile per l&#39;espressione di proteine ​​e carboidrati per studi strutturali mediante spettrometria di massa e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare isotopicamente arricchiti. Inoltre, la composizione della N-glicani può essere regolato aggiungendo una piccola molecola di evitare talune modifiche glicani in modo che non riduca la resa.

Espressione della proteina ad alto livello e la purezza Questo sistema di espressione ottimizzato generato un alto rendimento di proteine ​​glicosilate. Un modello tipico è mostrato nell&#39;espressione di IgG1-Fc (Figura 1). In questo caso, Giorno 0 è il giorno trasfezione seguito da Day 1 (diluizione) e nei giorni successivi della cultura fino al giorno 5. espressione della proteina viene analizzata ut...

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High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.5K Views.  Iowa State University. Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Video: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Ricerca

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute Quantum la misurazione del rendimento dei campioni di polvere

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

High Yield Espressione di proteine ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione