Le forze meccaniche generate dalle cellule sono essenziali per il corretto funzionamento in vari organi in tutto il corpo. Più la vescica intestinale, il cuore e altri. Questi organi devono generare modelli stabili di contrazione e rilassamento cellulare, per mantenere lo stato emostatico interno.
La contrazione anormale delle cellule muscolari lisce può portare all'insorgenza di vari disturbi, tra cui la dismotilità intestinale caratterizzare modelli anormali di intestinale con contrazione muscolare, nonché condizioni come la vescica iperattiva o ipoattiva. E nelle vie aeree, alcune cellule muscolari che contraggono modelli irregolari possono innescare l'iper-reattività asmatica. Chiaramente, i meccanismi contrattili all'interno di cellule e tessuti possono portare a malattie che richiedono opzioni di trattamento.
E poiché queste condizioni possono derivare direttamente da comportamenti contrattili disfunzionali delle cellule, diventa sia logico che necessario misurare la funzione contrattile cellulare stessa, quando si esaminano potenziali candidati farmaci. A seguito dei recenti progressi nella micro tecnologia, abbiamo sviluppato un test basato su micropiastre di facile utilizzo che consente misurazioni quantitative della contrazione di singole cellule. In centinaia di migliaia di celle chiamate flex, note anche come superfici elastomeriche contrattabili marcate fluorescentemente.
In questo approccio, incorporiamo micro modelli proteici fluorescenti e quindi film morbidi, che si deformano e si restringono quando le cellule applicano loro forze di trazione. È importante sottolineare che i micro modelli proteici limitano la posizione, la forma e l'area di diffusione delle cellule. Le condizioni di prova uniformi e consentono misurazioni semplici basate solo sulle loro variazioni dimensionali.
Nel complesso, la piattaforma, che include un modulo di analisi delle immagini basato su browser, consente un'analisi diretta della forza cellulare contraibile senza richiedere delicate procedure di manipolazione o registrazione di marcatori fiduciari e può essere gestita da qualsiasi ricercatore con le colture cellulari di base e un semplice microscopio fluorescente a basso ingrandimento. Questa tecnologia deve essere progettata pensando all'utente finale e mira a ridurre la barriera all'ingresso per qualsiasi scienziato di laboratorio per studiare la biologia della forza cellulare Inizia aggiungendo 20 millilitri di media in un tubo cronico, ottieni una piastra a 24 pozzetti progettata per testare la contrattilità cellulare. Imposta la tua pipetta su 500 microlitri e ottieni un colino cellulare per l'agente patogeno cellulare.
Rimuovere il coperchio sulla piastra a 24 pozzetti, tenere la piastra in questo modo, quindi procedere a togliere delicatamente lo strato di plastica sulla parte superiore della piastra. Impostare con attenzione il piatto verso il basso. Aspirare solo PBS di strato superiore da ciascun pozzetto per evitare qualsiasi fuoriuscita.
Ora, una riga alla volta, rimuovere il PBS rimanente dal pozzo e riempire rapidamente con 500 microlitri di supporti cellulari. Agitare delicatamente la piastra e picchiettare su un lato per assicurarsi che l'intero fondo del pozzo sia coperto di soluzione. Una volta che tutti i pozzi sono stati riempiti con i supporti, metti la piastra di lato.
A questo punto, recupera la tua coltura cellulare dall'incubatrice. Condurremo un solido protocollo di associazione. Lo scopo di questo protocollo è quello di creare una sospensione di 50.000 cellule per millilitro.
Prima di seminare le cellule, assicurati di filtrare le cellule una volta attraverso il colino, al fine di rompere grumi di cellule in singole cellule, posiziona con cura 500 microlitri della tua soluzione cellulare in ciascun pozzetto. Dopo la semina cellulare, è importante lasciare riposare le piastre per un'ora in modo che le cellule possano depositarsi direttamente sui modelli. Dopo un'ora, posizionare il piatto in un'incubatrice durante la notte.
La seconda parte dell'esperimento consiste nell'aggiunta dei farmaci alla piastra a 24 pozzetti e nell'imaging fluorescente della piastra. Per questa parte del protocollo abbiamo due requisiti importanti per garantire una robusta vitalità e risposta cellulare. Il primo è che la concentrazione finale di DMSO nei pozzetti con cellula non è superiore all'1%, il che significa che dobbiamo fare una diluizione completa di 100 dalle nostre scorte di farmaci.
Il secondo è che non possiamo aggiungere DMSO così direttamente ai pozzetti perché si schianterà sul fondo di quella miscelazione e quindi danneggerà le cellule con una concentrazione di alto livello. Invece, dobbiamo creare una soluzione intermedia di farmaco e media DMS0, che possiamo mescolare accuratamente insieme per evitare un'elevata esposizione DSSO locale alle cellule. In questo protocollo, faremo una diluizione di sei fasi otto volte che copre un intervallo da 40 micromolari fino a un nano molare Creare la serie di diluizione di sei fasi otto volte trasferendo 30 microlitri di soluzione di farmaco madre in volumi consecutivi di 210 microlitri di DMSO e mescolando accuratamente tra ogni fase di trasferimento Nel nostro esperimento, valuteremo l'effetto della blebbistatina.
sulle vesciche umane attraverso le cellule muscolari. Al fine di soddisfare entrambi i requisiti, creeremo prima un farmaco intermedio DMSO e una soluzione multimediale. Ciò produce una diluizione di 16,7 volte del DMSO.
Quindi aggiungeremo questa soluzione di farmaco intermedio alle nostre cellule, utilizzando proporzioni che producono un'ulteriore diluizione di sei volte, con conseguente diluizione totale di 100 diluizione completa e la concentrazione finale dell'1% DMSO Per raggiungere questo obiettivo, per ogni soluzione di farmaco madre, mescolare 30 microlitri di farmaco in 470 microlitri di terreno di coltura cellulare, quindi trasferire 200 microlitri di questa soluzione intermedia al pozzo appropriato sulla piastra a 24 pozzetti, che contiene 1000 microlitri in ogni pozzetto. Questo produce collettivamente una concentrazione finale dell'1% di DMSO Incubate per il periodo di tempo appropriato. Nel nostro esperimento, incubare per 30 minuti, quando sei pronto per l'immagine aggiungi una macchia nucleare viva su tutti i tuoi pozzi aggiungi una diluizione da uno a 10.000 dal magazzino.
Lasciare incubare per altri 15 minuti. Quando sei pronto per l'immagine, avrai bisogno di un microscopio fluorescente equipaggiato per visualizzare i canali fluorescenti sia per i nuclei cellulari etichettati che per il colorante fluorescente. I micro pattern sono etichettati con cui nel nostro esempio è il canale tri C.
Ora, saremo fluorescenti imaging blebbistatin nuclei al fine di identificare singole cellule, essere sicuri di visualizzare i nuclei di cellule macchia nella stessa esatta posizione in cui si visualizza il micro modello in modo che possano essere allineati durante l'analisi. Carica le immagini acquisite sul tuo computer per assicurarti che le immagini siano etichettate correttamente, in modo tale che i canali del pattern finiscano con il punto di sottolineatura PT. E le immagini nel canale nucleare terminano con underscore dapi. Ora, convertiremo le immagini tif in immagini PNG, usando l'immagine J Una volta che l'immagine J è aperta, carica in un canale alla volta.
Per prima cosa caricheremo il canale del pattern e regoleremo il contrasto, al fine di massimizzare il segnale e ridurre al minimo lo sfondo. Inoltre, smusseremo l'immagine. Una volta che l'immagine è stata modificata a nostro piacimento, cambieremo il tipo di immagine a otto bit.
Quindi esporta l'immagine come tipo PNG. Quindi selezionare la casella, utilizzare le etichette delle sezioni come nomi di file. Creare una nuova cartella denominata PNG.
Quindi salvare i file PNG lì, Per analizzare le immagini, passare a Biodock dot AI, creare un account e contattare gli autori per ottenere l'accesso gratuito al modulo di analisi. Accedi una volta creato il tuo account. Qui potrai caricare nuove immagini.
Chiameremo questo nuovo batch, dati di esperimenti web JoVE. Ora possiamo importare le immagini trascinandole e quindi rilasciandole, premere OK.At questo punto, selezionare i dati. Quindi fare clic su Analizza, scorrere verso il basso fino al modulo etichettato Analisi di contrattilità, quindi premere Seleziona.
Imposta l'ingrandimento sullo stesso valore che hai usato per l'imaging Una volta completati i dati, fai clic su di esso, quindi possiamo selezionare i dati di download. Una volta scaricati i dati, possiamo quindi vedere le coppie di immagini sovrapposte per ogni immagine immessa. Abbiamo anche accesso a una statistica riassuntiva che ci darà la contrazione media per ogni insieme di celle.
L'unità di misura per la contrazione è in pixel. Guardando i dati possiamo vedere qui che nei pozzi trattati solo con DMSO, c'è stata una contrazione molto più alta delle cellule rispetto a quelle cellule che sono state trattate con blebbistatina. Abbiamo anche accesso ai dati per ogni singolo modello, che è stato rilevato in una qualsiasi delle immagini.
Questo ci fornisce informazioni dettagliate sulla posizione dell'immagine, l'origine dell'immagine, il tipo di posizione, il numero di celle, zero una o più di una, la dimensione del micro modello e la contrazione calcolata delle celle. Questa posa è costituita da ogni singolo modello identificato all'interno della micro piastra. I modelli a cella singola di questo elenco erano nella media per calcolare la contrazione media per l'immagine PNG nell'altro file.
È possibile ordinare e analizzare i dati a cella singola in base alle esigenze dell'esperimento. Per questa parte del video, mostreremo dati rappresentativi che sono raccoglibili da una piastra a 24 pozzetti che mostra i dati di risposta delle cellule muscolari lisce della vescica trattate con due diversi farmaci. Queste sono immagini di pozzi trattati rispettivamente con DMSO e blebbistatina.
Qui, possiamo vedere che le cellule trattate solo con DMSO, mostrano un gran numero di micro modelli contrattuali, ma le cellule trattate con blebbistatin erano più grandi e aperte a notare che c'è meno contrazione. I dati in questo istogramma mostrano la variazione della contrattilità cellulare come risultato dei diversi trattamenti alle cellule. Il centro di distribuzione per le cellule trattate con blebbistatina è inferiore al centro di distribuzione per le cellule che sono state trattate con il DMSO.
Ciò è coerente con le informazioni visualizzate nelle immagini precedenti. Perché le cellule che sono state trattate con blebbistatina hanno mostrato una contrazione molto più piccola. Ciò denota che il trattamento con blebbistatina rilassa significativamente le cellule.
Ognuno di questi set di dati contribuisce a un punto sulla curva di risposta alla dose che è raccoglibile da una singola piastra a 24 pozzetti, seguendo i protocolli mostrati nel video. Qui, possiamo vedere che la citocalasina D è più potente del blebbistan come dimostrato dai valori più bassi di contrazione, date le più alte concentrazioni di farmaco. Se desideri ridimensionare in modo significativo i tuoi esperimenti, è disponibile una versione a piastra a 384 pozzetti e questa può essere utilizzata con l'automazione per ridimensionare drasticamente gli esperimenti.
Questi dati sono raccolti da una piastra da 384 pozzetti, piuttosto che avere sei fasi di diluizione per ciascun farmaco sulla piastra a 24 pozzetti, la piastra a 384 pozzetti ci consente di condurre 20 fasi di diluizione per ciascun farmaco con più repliche. La tecnologia dei fiocchi di neve è unica. Consente la visualizzazione della contrazione a singola cellula utilizzando la microscopia, che finora è stata impossibile.
Quindi, la tecnologia si basa sulla forma di metriche che è modellata con proteine marcate fluorescenti. Il modello sistematico deve formarsi per la contrazione cellulare e consente una misurazione precisa della modulazione di un contratto di fenotipo da parte di un dato farmaco. Naturalmente, questa tecnologia è ancora in fase di sviluppo attivo per applicazioni e molte diverse aree di malattia, come l'asma, le malattie cardiovascolari, l'infiammazione immune oncologica e, naturalmente, qualsiasi indicazione della nostra malattia in cui la contrazione cellulare anormale svolge un ruolo chiave nella progressione della malattia.
Come dimostriamo, questa tecnologia basata su micro patterning per la misurazione della contrattilità cellulare offre un'alternativa semplificata alla microscopia tradizionale della forza di trazione, fornendo un'analisi intuitiva, osservando il pattern ridursi e fornendo una risoluzione a singola cellula in grandi popolazioni cellulari. Alcune considerazioni, questo metodo può porre sfide per l'uso di cellule che sono troppo piccole, come le cellule T e neutrofili, o tipi di cellule che non aderiscono. Inoltre le cellule che settimanalmente si legano, si legano tra loro prevalentemente o che non si diffondono completamente, non produrranno segnali contrattili misurabili.
Gli utenti della tecnologia devono valutare attentamente diverse possibili formulazioni di terreni di coltura cellulare per il loro particolare tipo di cellula. poiché diversi componenti, fattori di crescita, livelli sierici e sensibilità al pH possono guidare comportamenti variabili. L'ottimizzazione dei protocolli dovrebbe procedere al ridimensionamento di eventuali flussi di lavoro sperimentali.
In definitiva, se la risoluzione di una singola cellula non è necessaria, o se il tipo di cellula bersaglio ha una capacità di diffusione minima, allora i metodi tradizionali di microscopia a forza di attrazione possono essere impiegati per tali esperimenti. Altrimenti speriamo che questo strumento fornisca un'ulteriore strada per i biologi cellulari per studiare la contrazione cellulare ed eseguire i loro studi.
