L'obiettivo generale di questa procedura è quello di riprodurre la maggior parte degli aspetti essenziali della malattia di Parkinson in un modello animale. La somministrazione stereotassica di vettori virali adeno-associati, che codificano la sinucleina umana nella substantia nigra. La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che comporta la morte del neurone dopaminergico, nella via nigrostriatale e, di conseguenza, la progressione della perdita di controllo del movimento volontario.
Questo processo neurodegenerativo è accompagnato, dalla deposizione di aggregati proteici nel cervello, che sono costituiti principalmente da sinucleina. Prove emergenti hanno indicato che gli aggregati di sinucleina possono stimolare i recettori toll-like sulla microglia, innescando così l'infiammazione neurale nella substantia nigra. Inoltre, le prove indicano che gli aggregati di sinucleina possono essere catturati e presentati, dalle cellule che presentano l'antigene alle cellule T, inducendo una risposta immunitaria adattativa specifica alla sinucleina.
La somministrazione stereotassica di vettori virali adeno-associati che codificano la sinucleina umana nella substantia nigra, ha dimostrato di riprodurre molti aspetti essenziali della malattia, tra cui la patologia sinucleina, l'attivazione microgliale, l'attivazione delle cellule T, la neurodegenerazione e la compromissione motoria. Questo studio presenta un'analisi di come un vettore virale e il tempo dopo la consegna del vettore virale, influenza l'estensione dell'espressione della sinucleina umana, la neurodegenerazione e la neuroinfiammazione nella via nigrostriatale, nonché il grado di compromissione motoria in un modello murino di consegna stereotassica unilaterale di sinucleina umana in substantia nigra. Per mantenere un ambiente asettico, indossare abiti chirurgici appropriati durante l'intero intervento chirurgico, compresi copriscarpe, maschera chirurgica, barriera sanitaria, guanti e cappuccio chirurgico.
Spruzzare etanolo sul topo e su tutto il materiale chirurgico, per mantenere l'ambiente asettico. Per indurre un'analgesia, iniettare carprofene per via sottocutanea ogni 12 ore, iniziando un'ora prima dell'intervento chirurgico e continuando fino a tre giorni dopo l'intervento chirurgico. Per anestetizzare il topo, posizionare l'animale in una camera di induzione.
Aprire il flusso di isoflurano ad una velocità dello 0,5% e quindi aumentarlo lentamente fino al 5% per circa cinque minuti fino a quando il mouse non ha perso il riflesso di raddrizzamento. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione. Trasferire immediatamente l'animale su un circuito non respirante con un cono nasale di dimensioni appropriate.
Mantenere l'anestesia del topo, con isoflurano 1% per tutto il tempo dell'intervento chirurgico. Conferma che il mouse sia completamente anestetizzato pizzicando le code e le zampe. Quando il mouse non reagisce quando pizzica la coda e le zampe, significa che il mouse è completamente anestetizzato.
Rasare la testa del topo usando le forbici. Pulire la pelle del topo con un batuffolo di cotone con clorexidina 2% e rimuovere tutti i capelli. Fissare la testa del mouse nella cornice stereotassica.
Posizionare un protettivo corneale in entrambi gli occhi del topo, usando un batuffolo di cotone. Per prevenire l'induzione dello stress in altri roditori, evitare la presenza di qualsiasi altro topo nella sala operatoria. Pulire la testa del topo con tre colpi di clorexidina 2% seguita da etanolo 70%Esporre il cranio utilizzando materiale chirurgico e praticare un foro sottile con un trapano alle coordinate anteroposteriorie 2,8 mm e mediolaterale 1,4 mm, rispetto alla linea mediale.
Mettere l'ago di una siringa da 10 microlitri nel foro e spostare l'ago all'interno del cervello lentamente, fino ad arrivare a 7,2 mm dorsoventrali, rispetto alla dura. Lasciare l'ago nella posizione finale per due minuti, per consentire al tessuto di depositarsi un po ', quindi iniettare un microlitro di vettori virali nella giusta substantia nigra, ad una velocità di 0,2 microlitri ogni 30 secondi. Lasciare l'ago nella stessa posizione per cinque minuti dopo la consegna dei vettori virali, quindi ritirarlo lentamente.
Chiudere la ferita usando una sutura di seta sterile. Metti il mouse nella gabbia di casa, preriscaldato posizionandolo su un materasso caldo elettrico. 12 settimane dopo l'intervento stereotassico, valutare le prestazioni motorie, utilizzando una versione semplificata del test del fascio, descritto in precedenza.
A tale scopo, utilizzare una trave orizzontale di 25 cm di lunghezza e 3 cm di larghezza. La superficie del fascio deve essere coperta da una griglia metallica con quadrati di un centimetro ed elevata di un centimetro sopra la trave. Fai un video del mouse, mentre attraversi il raggio della superficie della griglia, da un'estremità all'estremità opposta del raggio, dove si trova la gabbia domestica.
Addestrare il mouse per due giorni, prima della determinazione delle prestazioni del motore. Il primo giorno, allena il mouse a camminare attraverso il raggio cinque volte, senza la griglia. Il secondo giorno, allena il mouse a camminare attraverso il raggio, in presenza di griglia cinque volte.
Il terzo giorno, valutare le prestazioni del motore. Per fare ciò, quantifica il numero di errori eseguiti, dalle zampe sinistre o dalle zampe destre separatamente, guardando i video in modalità slow-motion. Per anestetizzare il topo, iniettare una miscela di ketamina e xilazina per via intraperitoneale.
Una volta che il topo è completamente anestetizzato, aprire il torace con materiale chirurgico ed esporre il cuore. Quindi inserire un ago a punta piatta, nel ventricolo sinistro del cuore. Accoppiando l'ago a un tubo, perfondere 50 millilitri di soluzione salina tampone fosfato, ad una velocità di 9,5 millilitri al minuto, utilizzando una pompa peristaltica.
Rimuovere il cervello usando forbici e pinzette, quindi fissarlo per immersione, in cinque millilitri di paraformaldeide al 4%, in soluzione salina tampone fosfato. Successivamente, metti il cervello fisso, in 15 millilitri di saccarosio al 30% per 48 ore. Quindi metti il cervello in quattro millilitri di soluzione di crioprotezione e salva il cervello a 80 gradi, o usalo immediatamente nella fase successiva.
Per ottenere fette striatali, tagliare il cervello in sezioni spesse 40 micrometri, a partire da 1,34 mm e finendo a 0,26 mm. Raccogli ogni fetta in un criotubo da due millilitri, seguendo l'ordine anteroposteriore. Per effettuare analisi immunoistochimiche e immunofluorescenti nello striato, scegliere cinque sezioni striatal coronali prese a intervalli uniformi, che coprono l'intera estensione rostrocaudale del nucleo.
Per convalidare la corretta consegna di vettori virali nei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale, sono stati iniettati vettori che codificano GFP, nella substantia nigra, e 12 settimane dopo, la fluorescenza GFP e l'immunoreattività tirosina idrossilasi sono state analizzate nella substantia nigra e nello striato mediante immunofluorescenza. La fluorescenza associata alla GFP, è stata localizzata esclusivamente nel sito ipsilaterale, ed è stata osservata una significativa colocalizzazione con immunoreattività tirosina idrossilasi sia nella substantia nigra che nello striato, indicando la corretta consegna di vettori virali nei neuroni dopaminergici della via nigrostriatale. Per testare la dose di vettori, codificando la sinucleina richiesta, per indurre una significativa sovraespressione di sinucleina umana che promuove la neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nigrali, sono state iniettate diverse dosi dei vettori.
E 12 settimane dopo, l'immunoreattività della sinucleina umana e l'estensione dell'immunoreattività della tirosina idrossilasi sono state testate nella via nigrostriatale. L'immunoreattività della sinucleina umana è risultata evidente, con tutte le dosi testate nella substantia nigra. Tuttavia, solo i topi che ricevevano da 10 a 10 genomi virali per topo, presentavano un'evidente immunoreattività della sinucleina umana, nello striato.
I topi che hanno ricevuto da 10 a 10 genomi virali per topo di vettori che codificano la sinucleina umana, hanno mostrato una significativa perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra. Sebbene i topi che ricevevano la stessa dose di vettori che codificavano GFP, mostrassero un basso grado di perdita neuronale, questi topi presentavano un grado significativamente più basso di neurodegenerazione, rispetto a quei topi che ricevevano vettori, codificando la sinucleina umana. Utilizzando il test del fascio, è stata rilevata una significativa riduzione delle prestazioni motorie esclusivamente in quei topi, che ricevono da 10 a 10 genomi virali per topo di vettori che codificano la sinucleina umana, quando si confronta il numero di errori commessi dalla zampa destra e dalla zampa sinistra, o quando si confronta il numero totale di errori, di topi che ricevono vettori che codificano sinucleina umana, con quei topi che ricevono il vettore di controllo.
Per definire l'insorgenza dell'espressione della sinucleina umana, i topi sono stati trattati con 10-10 genomi virali per topo, di vettori che codificano la sinucleina umana o chirurgia fittizia, e l'estensione dell'espressione della sinucleina umana è stata analizzata nella substantia nigra, una volta alla settimana, durante le settimane da due a cinque dopo l'intervento stereotassico. I risultati mostrano che l'espressione della sinucleina umana ha iniziato ad essere evidente alla quinta settimana dopo l'intervento stereotassico. Per determinare il picco di attivazione microgliale, l'estensione delle cellule che esprimono alti livelli di Iba1, è stata quantificata nello striato dei topi, durante le settimane 2-15 dopo l'intervento chirurgico.
I risultati mostrano un aumento significativo dell'attivazione microgliale del lato ipsilaterale, rispetto al lato controlaterale dei topi, 15 settimane dopo l'inoculazione virale. Il numero di cellule T regolatorie infiltrate nel nigra sostanziale è stato analizzato in diversi punti temporali, dopo l'intervento stereotassico mediante immunofluorescenza, seguita dall'osservazione al microscopio confocale. Il picco di infiltrazione regolatoria delle cellule T nella substantia nigra è stato osservato alla settimana 11 dopo l'intervento chirurgico.
Il modello murino di neurodegenerazione qui analizzato, rappresenta un modello utile per studiare i numeri di coinvolgimento degli aspetti chiave nella fisiopatologia della malattia di Parkinson. Meccanismi di coinvolgimento coinvolti nella patologia della sinucleina, nell'attivazione microgliale, nel coinvolgimento del sistema immunitario periferico, nella neuroinfiammazione e nei meccanismi di neurodegenerazione Una dose adeguata di vettore virale adeno-associato, sottotipo cinque che codifica la sinucleina umana per indurre neurodegenerazione, neuroinfiammazione, infiltrazione delle cellule T e compromissione motoria, è da 10 a 10 genomi virali per topo. Questo studio dimostra, che cinque settimane dopo l'intervento stereotassico, costituisce un punto temporale chiave, in cui l'espressione della sinucleina umana era già evidente, ma in assenza di compromissione motoria in questo modello animale.
Quindi, questo punto temporale, rappresenta un punto temporale interessante, per iniziare la somministrazione di terapie sperimentali su misura per fermare il progresso della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione. Il punto temporale più adatto per analizzare la neuroinfiammazione in questo modello animale, è alla settimana 15 dopo un intervento chirurgico stereotassico. Mentre un punto temporale adeguato per analizzare l'infiltrazione delle cellule T nel sistema nervoso centrale.
sembra essere alla settimana 11 dopo l'inoculazione del vettore virale.
