La stima del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra è una misura chiave del risultato nella ricerca sul morbo di Parkinson. Questo protocollo riduce significativamente il carico di lavoro necessario per stimare il numero di neuroni. Questo metodo fornisce un processo efficiente in termini di tempo e accurato per rilevare i cambiamenti nel numero di neuroni dopaminergici ed è adatto per determinare l'effetto degli interventi sulla sopravvivenza cellulare.
Questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per fornire conteggi accurati dei neuroni in diverse regioni cerebrali mantenendo al contempo vantaggi in termini di costi e tempo rispetto ai metodi stereologici tradizionali. Per acquisire immagini IHC utilizzare il software accoppiato a un microscopio confocale con ingrandimento 10X. Aprire il foro del perno a 1,5 unità di area per catturare un piano largo per un totale di 1,5 micrometri e impostare la messa a fuoco sul lato iniettato del cervello.
Nella scheda acquisizione controllare l'opzione di imaging della scansione dei riquadri e impostare le dimensioni su 10 per quattro. Nel pannello modalità di acquisizione impostare lo zoom su 1.1 per evitare segni di cucitura tra le immagini di scansione del riquadro. Impostare le dimensioni del fotogramma su 1024 per 1024 pixel e la media su due per garantire un'acquisizione di immagini di alta qualità.
Nel pannello canali impostare traccia uno su Alexa 488 e traccia due ad Alexa 555. Caricare la diapositiva sul palco e scegliere una sezione con una forte colorazione TH. Clicca in diretta sul pannello di acquisizione.
Nel pannello canali impostare la forza e il guadagno del laser su livelli che massimizzano il segnale e limitano il rumore di fondo. Utilizzare l'indicatore di intervallo per assicurarsi che i segnali non siano sovraesposti. Ripetere questa situazione con più diapositive.
Nella scheda acquisizione selezionare la casella posizioni. Per iniziare l'imaging, utilizzare l'oculare e scegliere la prima sezione che mostra la colorazione TH positiva. Quindi impostare lo stato attivo nel punto di interesse e spostare lo stage sulla linea mediana della sezione.
In questo modo viene salvata la posizione negli assi X, Y e Z e verrà etata una scansione del riquadro che cattura l'intera sezione. Ripetere questa ripetizione per tutte le altre diapositive, incluso un sito non iniettato. Separare i file di immagine utilizzando il software appropriato e importarli in un software di analisi automatica delle immagini.
Definite una regione di interesse selezionando lo strumento di annotazione a penna per disegnare un'annotazione attorno alla substantia nigra pars compacta. Passare alla scheda analisi e selezionare Ottimizzazione in tempo reale dal menu di analisi a discesa. In questo modo viene aperta una finestra separata sull'immagine della sezione che consente la modifica in tempo reale dei parametri di analisi.
Nella sezione ingrandimento analisi selezionare lo zoom dell'immagine appropriato. Nella sezione di rilevamento delle cellule selezionare il colorante nucleare come colorante utilizzato per la colorazione TH. Regolare la soglia di contrasto nucleare, l'intensità nucleare minima, l'aggressività della segmentazione nucleare e le impostazioni delle dimensioni nucleari, osservando attentamente la finestra di sintonizzazione del tempo.
Ripetere questo processo con più campioni. Una volta che un numero appropriato di immagini è stato campionato e l'ottimizzazione in tempo reale è stata regolata di conseguenza, salvare le impostazioni di analisi nel menu a discesa delle azioni delle impostazioni. Selezionare tutte le immagini da analizzare e fare clic su analizza.
Scegliete l'impostazione di analisi appena salvata e nella finestra area di analisi selezionare la casella livelli di annotazione, quindi selezionare il livello uno e fare clic su analizza. Una volta completati, esportare i dati di analisi di riepilogo per tutte le sezioni selezionando l'opzione per esportare i dati di analisi degli oggetti. Questo set di dati potrebbe essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule in risposta a una tossina o terapeutica.
Sei settimane dopo l'adeno associato al virus o alle iniezioni di AAV, l'iniezione stereotassica di AAV che esprime la sinuleina alfa A53T mutante nella substantia nigra nel cervello del ratto ha portato a una significativa riduzione della densità dei neuroni dopaminergici. Il numero medio di neuroni th positivi per millimetro al quadrato nella substantia nigra dei ratti iniettati con AAV-A35T è stato significativamente diminuito rispetto a quello dei ratti iniettati con il vettore vuoto AAV. Osservazioni simili sono state fatte usando una stereologia imparziale.
Quando si tenta questo protocollo tenere a mente il software è utile solo quanto viene addestrato ad essere. Pertanto, è necessario prestare tempo e attenzione per garantire che una singola cellula sia identificata come una singola cellula. Il software può essere adattato per misurare un'intensità di fluorescenza di altre proteine di interessi come l'alfa-sinucleina per determinare se i trattamenti possono modulare i livelli proteici.
Questa tecnica ha permesso una maggiore efficienza durante il test dell'effetto di molteplici potenziali terapie sulla densità dei neuroni dopaminergici.
