Protocollo per lo sviluppo e l'impianto di blastocisti umani per la modellazione di blastocisti

La ricerca sugli embrioni umani è limitata dalla loro scarsa disponibilità e preoccupazioni etiche, quindi ottenere modelli individuali che replicano fedelmente lo sviluppo umano precoce sosterrebbe il progresso scientifico e medico. La capacità di questa tecnica di prevedere lo sviluppo umano dipende dalla sua capacità di riprodurre efficacemente le sequenze di determinazione cellulare della blastocisti e morfogenesi, secondo la sequenza e il ritmo dello sviluppo, e tale modellazione garantirebbe la formazione di cellule che riflettono veramente lo stadio della blastocisti. In futuro, i blastoidi umani potranno essere utilizzati per identificare bersagli terapeutici e contribuire alla modellazione pre-clinica, ad esempio per migliorare un mezzo di fecondazione in vitro o per sviluppare contraccettivi non ormonali.

A dimostrare la procedura saranno Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer e Giovanni Sestini. Per iniziare, preparare e preriscaldare i supporti PXGL, i supporti basali N2B27, il tampone di lavaggio, il PBS e i mezzi di aggregazione. Escludere i MEF dalla sospensione hPSC per la formazione di blastoidi.

Per l'esclusione del MEF, preparare una piastra rivestita di gelatina aggiungendo un millilitro di gelatina allo 0,1% nel pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30-90 minuti. Per raccogliere le cellule, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con un millimetro di PBS.

Aggiungere 500 microlitri di soluzione di distacco cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Controllare le cellule al microscopio per seguire la dissociazione delle colonie in singole cellule. Diluire la soluzione di distacco cellulare con un millilitro di tampone di lavaggio.

Raccogliere le cellule dalla piastra pipettando delicatamente da cinque a 10 volte. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Abbassare le celle a 200 RCF per quattro minuti.

Rimuovere il surnatante e risospescere le cellule in 1,5 millilitri di mezzo PXGL in ciascun pozzetto. Seminare le cellule sulle piastre rivestite di gelatina per l'esclusione del MEF e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 60-90 minuti. Una volta che le cellule naïve sono state seminate per l'esclusione MEF, rimuovere il PBS da MicroWells ed equilibrare i pozzetti con 200 microlitri di mezzo N2B27 basale per ogni chip MicroWell e incubare per 60 minuti a 37 gradi Celsius.

Raccogli il surnatante contenente le cellule naïve non attaccate. Trasferirlo in un tubo da 15 millilitri e ruotare le celle a 200 RCF per quattro minuti. Scartare il supporto e risospescere le cellule in un millilitro di terreno basale N2B27.

Contare le celle utilizzando le diapositive di conteggio delle celle. Abbassare le celle a 200 RCF per quattro minuti. Scartare il mezzo e aggiungere una quantità appropriata di supporto N2B27 contenente 10 micromolari Y27632 per ottenere una densità cellulare di 30.000 celle per 50 microlitri.

Rimuovere il mezzo da array MicroWell bilanciati e aggiungere 25 microlitri di supporti N2B27 con 10 micromolari Y27632. Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti per consentire alle cellule di cadere nella parte inferiore del MicroWell. Quindi aggiungere 125 microlitri di N2B27 medio, integrati con 10 micromolari Y27632.

Entro 24 ore, aggregati di hPSC ingenui saranno osservati sul chip MicroWell. Avviare la formazione di blastoidi preparando il mezzo PALY. Preriscaldarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Rimuovere il mezzo di aggregazione e aggiungere 200 microlitri di mezzo PALY prebellico ai MicroWell. Riposizionare la piastra di coltura cellulare in un incubatore ipossico a 37 gradi Celsius. Ripeti il cambiamento dei media il primo giorno.

Il secondo giorno, rimuovere il mezzo PALY e aggiungere 200 microlitri di mezzo N2B27, integrati con LPA e 10 micromolari Y27632. Ripeti il cambiamento dei media il terzo giorno. La formazione completa di blastoidi avviene entro il quarto giorno.

Preparare la sospensione cellulare hPSC naïve per la formazione di blastoidi come descritto in precedenza. Scartare il mezzo e aggiungere una quantità appropriata di supporti N2B27 contenenti 10 micromolari Y27632 per ottenere la densità cellulare di 70 celle per 100 microlitri del mezzo. Per raggruppare le cellule sul fondo dei pozzetti, centrifugare la piastra a 200 RCF per due minuti a temperatura ambiente.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in condizioni di coltura ipossica. Entro 24 ore, aggregati di hPSC ingenui saranno osservati sui pozzi. Aggiungere 100 microlitri di mezzo PALY appena preparato e preriscaldato due volte ai pozzi.

Riposizionare la piastra di coltura cellulare in un incubatore ipossico a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, scartare metà del supporto e sostituirlo con 100 microlitri di mezzo PALY preriscaldato. Ripeti il passaggio fino al quarto giorno.

Preparare la sospensione cellulare HPSC naïve per la formazione della troposfera come descritto in precedenza. Una volta che gli aggregati di HPSC ingenui si sono formati dopo 24 ore, scambia il mezzo di aggregazione con PALY senza LIF, integrato con tre MICROMOL SC144 per formare trofosfere che rappresentano il trofoectoderma precoce. Per formare trofosfere che rappresentano il trofoectoderma maturo, scambiare il mezzo di aggregazione con PALY, integrato con due XMUMP1 micromolari.

Aggiorna il mezzo ogni giorno. La formazione completa della trofosfera avviene entro il quarto giorno. Per valutare gli stati cellulari, confrontare i dati trascrittomici da blastoidi e trofosfere con i controlli appropriati, comprese le cellule staminali del trofoblasto umano post-impianto.

Le hPSC naive coltivate in PXGL sono state strutture aggregate e cavitate che sono emerse tra 48 e 72 ore dopo l'induzione di PALY e hanno raggiunto un diametro da 150 a 250 micrometri entro 96 ore. Sulla base dei parametri morfometrici e della presenza dei tre lignaggi, l'efficienza di induzione ha raggiunto il 70-80% Le trofosfere si sono formate con un'efficienza compresa tra il 50 e il 60% entro 96 ore dall'induzione. La formazione di blastoidi ha avuto successo nelle piastre a 96 pozzetti ad attacco ultra basso disponibili in commercio in condizioni di induzione ottimizzate.

La tecnologia di sequenziamento dell'RNA a singola cellula è stata utilizzata per caratterizzare ulteriormente lo stato delle cellule blastoidi. Le cellule mostrano profili di clustering marcatamente riproducibili, indipendentemente dai parametri utilizzati per eseguire il clustering e la visualizzazione dei dati, il che ha permesso di distinguere con sicurezza i tre lignaggi di blastocisti. Tra le 24 e le 60 ore, le cellule staminali pluripotenti PXGL formano analoghi dell'epiblasto e del trofoectoderma.

Quindi tra 60 e 96 ore si formano analoghi del trofoectoderma polare e dell'endoderma primitivo. Questa è la sequenza di specificazione all'interno della blastocisti, quindi i blastoidi ricapitolano la sequenza di sviluppo della specifica del lignaggio. La fusione di set di dati di blastoidi con il set di dati di riferimento di cellule isolate da embrioni in diversi stadi di sviluppo ha mostrato che il 97% delle cellule di blastoidi si raggruppava con le cellule di blastocisti, ma non con cellule di embrioni post-impianto.

Analisi indipendenti hanno confermato che nel tempo, le cellule staminali hanno formato cellule che si sono abbinate trascrizionalmente alle cellule degli embrioni umani tra il quinto e il 7,5° giorno. Questa è infatti la fase di sviluppo durante la quale si forma la blastocisti umana. Hanno anche confermato che oltre il 95% delle cellule all'interno dei blastoidi ha un trascrittoma che corrisponde alle tre linee cellulari delle blastocisti, mentre il 3% delle cellule era fuori bersaglio e abbinato alle fasi post-impianto.

Da notare, abbiamo osservato che le nostre colture 2D iniziali comprendono anche circa il 5% delle cellule bersaglio. Lo stadio di sviluppo equivalente può anche essere visualizzato osservando i modelli di espressione di marcatori specifici come CDX2 per il trofoectoderma blastocisti e PRMD14 per l'epiblasto blastocisti. La qualità della coltura PXGL iniziale è assolutamente cruciale e anche il numero di cellule all'interno dell'aggregato iniziale è critico e può essere controllato utilizzando MicroWells.

La dimensione complessiva dell'aggregato cellulare dopo 24 ore dovrebbe essere di circa 50-70 micrometri. L'efficiente formazione di blastoidi di fase completa sta aprendo la strada allo studio dei processi di impianto e di sviluppo post-impianto dell'embrione umano.