Utilizzando questo metodo di citometria a flusso quantitativo, i ricercatori possono calcolare le abitudini cinetiche e di equilibrio dell'interazione di membrana introdotta e stimare il numero di proteine introdotte dai siti sulla membrana PPH. I vantaggi di questo metodo sono la semplicità e la disponibilità di reagenti e attrezzature. Questo metodo è esclusivamente per la ricerca di base.
Il protocollo è stato sviluppato per studiare le interazioni lipidiche proteiche nel calcolo del sangue e può essere utilizzato in altre aree per caratterizzare l'interazione delle proteine con varie membrane lipidiche. Il metodo può essere utilizzato per la valutazione quantitativa delle dinamiche di legame del ligando sulle varie cellule e tipi di ligando. Inizia gli esperimenti di legame cinetico diluendo le vescicole fosfolipidiche nel tampone di Tyrode a una concentrazione di un micromolare e un volume totale di 250 microlitri.
Quindi mescolare il fattore X della coagulazione marcato fluorescente o FX FD e una concentrazione di 500 nanomolari con le vescicole fosfolipidiche in un rapporto uno a uno per ottenere un volume totale di 500 microlitri. Iniettare immediatamente 500 microlitri della sospensione mista nel citometro a flusso. Ad una portata con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e un filtro di emissione di 585 nanometri; con una larghezza di 42 per il canale FL due.
Successivamente misurare la fluorescenza media nel canale FL quattro con eccitazione a 633 nanometri e filtro di emissione a 660 nanometri con una larghezza di 20. Quando si raggiunge la saturazione del legame, diluire rapidamente il campione di 20 volte con il tampone di Tyrode e monitorare la dissociazione fino a raggiungere una fluorescenza basale o un plateau. Per esperimenti di legame all'equilibrio incubare cinque vescicole artificiali di fosfolipidi artificiali micromolari con concentrazioni variabili di FX FD da zero a 1000 nanomolari nel tampone di Tyrode per 20 minuti.
Dopo l'incubazione diluire ogni campione di 20 volte a un volume finale di 200 microlitri con il tampone di Tyrode, quindi analizzare il campione diluito mediante citometria a flusso entro 30 secondi. Per analizzare i dati, esportare gli esperimenti in formato FSC dal software di acquisizione dati di citometria al software di citometro per l'analisi dei dati. Scegliendo il file e quindi facendo clic sulle schede Esporta e File FSC.
una volta fatto aprire i file FCS nel software cytometer selezionando i file sul computer e trascinando i file nell'area di lavoro del programma. Per gating le microvescicole, identificare la regione delle microvescicole mediante fluorescenza del colorante lipofilo, DIC 16 tre. Quindi utilizzare il pulsante di stampa nel foglio di lavoro per creare un SSC dot plot da FL due D I C 16 in coordinate di registro.
Quindi scegli il pulsante del cancello rettangolare per disegnare una regione di gating. Per analizzare gli esperimenti cinetici creare un dot plot utilizzando le coordinate di fluorescenza nel tempo per la regione delle vescicole. Successivamente, esporta i dati sulla variazione della fluorescenza nel tempo nel formato CSV; andando a scegliere il campione e facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda di esportazione, seguito dalla scelta di FL quattro volte nei parametri, seleziona la directory per il salvataggio prima di fare clic su seleziona formato CSV e premere la scheda di esportazione.
Dopo il trasferimento, aprire il file CSV nel software statistico per calcolare la semplice fluorescenza della media mobile e il tempo per ogni 1000 eventi approssimare un grafico della dipendenza della singola fluorescenza della media mobile sul tempo sotto l'ipotesi della dipendenza esponenziale e utilizzare il valore per calcolare la costante di associazione cinetica utilizzando un'equazione. Quindi calcolare la costante di dissociazione cinetica utilizzando l'equazione come descritto in precedenza. Per analizzare la data del test di legame di equilibrio, determinare la fluorescenza media di FX FD nella regione delle vescicole per ogni concentrazione selezionata di FX FD e quindi approssimare la dipendenza della fluorescenza del fattore legato dalla concentrazione del fattore aggiunto nell'ipotesi del legame a sito singolo.
Calcola i parametri di legame medi utilizzando un'equazione da tre ripetizioni indipendenti come minimo. Procedere alla preparazione di perline calibrate incubando piastrine filtrate in gel con calcio IANA 4A ventitré, centottantasette in presenza di cloruro di calcio millimolare 2,5 millimolare per 10 minuti a temperatura ambiente. Le piastrine attivate aggiungono le varie concentrazioni di FX FD e incubano le piastrine con il due percento di formaldeide in volume.
Dopo un'ora, interrompere la reazione incubando le piastrine con tre glicina molare e 5% BSA per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi purificare la miscela dal colorante non reagito con centrifugazione a 400 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernato prima di riutilizzare il pellet nel tampone di Tyrode contenente lo 0,5% di BSA.
Quindi, misurare il livello di fluorescenza delle perle di calibrazione in ciascun campione utilizzando uno spettrofluorometro e quindi utilizzando il citometro a flusso. Determinare il numero di perline in ciascun campione con l'aiuto di un contatore di celle. Convertire l'intensità di fluorescenza di ciascun rispettivo campione di perline nella concentrazione di colorante fluorescente solubile utilizzando uno spettrofluorometro e ricalcolare la concentrazione di colorante fluorescente per il numero di molecole dello spettrofluorometro.
Creare un grafico di dipendenza della fluorescenza media delle perline in un citometro a flusso sul numero di molecole di fluroforo per ciascun campione. Quindi approssimare la dipendenza in base alla proporzionalità della linea utilizzando il raccordo di analisi e adattare le linguette lineari in ordine. Dall'approssimazione nell'equazione, calcolare il fattore di conversione della fluorescenza media ai siti di legame.
Successivamente calcolare il numero apparente dei siti di legame per vescicola di interesse. L'analisi rappresentativa mostra il gating delle vescicole lipidiche artificiali al fosforo che hanno una dimensione di un micrometro con il colorante fluorescente lipofilo incorporato, colorante I C 16, il gate è stato impostato sulla base di un campione contenente vescicole lipidiche artificiali della stessa dimensione senza il colorante fluorescente. La cinetica del legame proteico alle vescicole è stata analizzata nella prima fase raccogliendo il campione in modo continuo.
I dati ottenuti sono stati analizzati utilizzando la citometria a flusso. Le misurazioni citometriche a flusso dovrebbero iniziare il prima possibile dopo aver miscelato le soluzioni e diluito con il tampone di Tyrode. Il metodo proposto potrebbe essere integrato con la risonanza plasmatica di superficie per lo studio delle interazioni di membrana che è altamente sensibile con una buona risoluzione temporanea e non richiede la consegna portata Il principale vantaggio di questo metodo è la sua accessibilità e semplicità.
