Questo protocollo è significativo in quanto non solo dimostra approcci per purificare le vescicole dalla cultura a diverse scale, compromessi, differenze tra le metodologie e anche considerazione per lavorare con campioni di campo. I cianobatteri presentano sfide uniche per il campionamento e l'analisi delle vescicole. Queste tecniche hanno isolato e concentrato con successo le vescicole dalla coltura e da campioni ambientali.
Per concentrare campioni inferiori a 500 millilitri, iniziare con il risciacquo dei concentratori centrifughi di ultrafiltrazione da 15 a 20 millilitri con acqua di grado ultrapuro di tipo 1. Caricare i concentratori nella centrifuga e ruotare a 4.400 x g a quattro gradi Celsius. Scartare la corsa e ripetere il passaggio almeno due volte.
Caricare il campione di surnatante in un concentratore risciacquato con acqua e girare nelle stesse condizioni. Ripetere questo passaggio fino a quando il campione non è concentrato in un volume finale da 15 a 30 millilitri. Per concentrare un volume di oltre 500 millilitri, eseguire la filtrazione a flusso tangenziale impostando l'apparecchio come descritto nel manoscritto.
Collegare una pompa peristaltica alla linea di aspirazione e posizionare morsetti regolabili sulla linea di retentato. Disinfettare la filtrazione a flusso tangenziale come descritto nel manoscritto, quindi lavare il dispositivo con un litro di acqua di tipo 1 di grado ultrapuro. Aggiungere meno di 0,2 micron di filtrato nel serbatoio del campione.
Aumentare lentamente la velocità della pompa e i livelli di contropressione sulla linea di retentato per aumentare la produzione dalle linee di filtrato. Continuare a eseguire la filtrazione a flusso tangenziale e riempire il serbatoio con il surnatante di coltura mentre il materiale viene rimosso. Interrompere la concentrazione del campione una volta che il volume nel serbatoio raggiunge la quantità più bassa possibile necessaria per mantenere il flusso nella linea di aspirazione senza introdurre bolle d'aria.
Chiudere la linea di deflusso con un morsetto. Rimuovere la contropressione sulla linea di retentate. Ricircolare il surnatante concentrato attraverso il filtro per 10 minuti, riducendo la velocità di ricircolo da 20 a 40 millilitri al minuto per massimizzare il recupero.
Spostare la linea di ritenzione in un recipiente pulito, rimuovere la linea di aspirazione dal campione e raccogliere il materiale concentrato. Recuperare il materiale rimanente nel serbatoio del campione utilizzando una pipetta. Filtrare il surnatante concentrato attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron.
Se necessario, conservare il concentrato finale a quattro gradi Celsius per circa tre settimane prima di passare alla purificazione delle vescicole. Per pellettizzare il campione di coltura concentrato, metterlo in un tubo ultracentrifuga pulito e aggiungere un mezzo pulito o un tampone per garantire che il tubo sia riempito. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con una pipetta.
Lavare nuovamente il materiale pellettato con terreni di coltura freschi o tampone di lavaggio, come 1X soluzione salina tamponata con fosfato e ripetere la centrifugazione. Risospendare il pellet finale in coltura fresca mediante un pipettaggio delicato con una pipetta da un millilitro e trasferirlo in un recipiente pulito. Per eseguire l'ultracentrifugazione del gradiente di densità, preparare le scorte di iodixanolo come descritto nel manoscritto.
Mescolare una parte del tampone 4X con tre parti di stock di iodixanolo al 60% per ottenere una soluzione di iodixanolo al 45%. Diluire il 45% di iodixanolo con tampone 1X per creare scorte di mezzi gradienti di 40, 35, 30, 25, 20, 15 e 10% concentrazioni finali di iodixanolo. Quindi, sovrapporre con attenzione quantità uguali di tutti questi stock di gradiente di iodixanolo in un tubo ultracentrifuga, utilizzando l'intero volume del tubo.
Dopo la centrifugazione, raccogliere le frazioni di 0,5 millilitri ciascuna per circa un gradiente di 4,5 millilitri mediante pipettaggio accurato o utilizzando un collettore di frazioni. Determinare la densità di ciascuna frazione, in grammi per millilitro, utilizzando una bilancia analitica e una pipetta calibrata. Rimuovere il campione dalla provetta, determinare il peso e restituire il campione alla provetta.
Diluire le singole frazioni con tampone pulito in un nuovo tubo seguito da un mezzo pulito o da un lavaggio tampone. Applicare con attenzione cinque microlitri di vescicola e lasciarlo riposare per cinque minuti. Rimuovere il campione toccando il bordo di una griglia su un pezzo di carta da filtro pulita.
Pipettare da 20 a 50 microlitri di acetato di uranile al 2% su una superficie piana coperta da film plastico. Quindi posizionare la griglia che galleggia sopra di essa per due minuti. Rimuovere l'acetato di uranile usando carta da filtro e galleggiare brevemente su una goccia di acqua ultrapura per lavare.
Riempire la camera con acqua ultrapura usando una siringa pulita e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria. Fare clic su start camera' e visualizzare la regione ottimale della camera attorno all'impronta digitale. Fai scorrere i cursori del guadagno dello schermo e del livello della fotocamera verso il massimo, quindi diminuisci al livello più basso per vedere le particelle più deboli.
Regolare la messa a fuoco secondo necessità per garantire che le particelle siano approssimativamente ugualmente visibili in tutto il campo visivo e continuare il lavaggio con acqua ultra pulita fino a quando la camera non è pulita. Aggiungere il campione di vescicola alla camera utilizzando una siringa da un millilitro e confermare le impostazioni di acquisizione. Seleziona la misurazione standard dalla casella a discesa SOP e modifica le impostazioni per raccogliere almeno tre repliche tecniche di video di 60 secondi ciascuna.
Premere create'and run script' e seguire le istruzioni e spingere circa 100 microlitri di campione nella camera tra le repliche. Determinare i parametri delle particelle facendo clic su analisi 'e apri esperimento' e caricare il file di esempio. Selezionare elabora i file selezionati e attendere il completamento dell'analisi.
L'isolamento e la caratterizzazione delle vescicole extracellulari dal cianobatterio Synechocystis sp. PCC6803, ha dimostrato che la membrana esterna contiene carotinoidi, che conferiscono una caratteristica colorazione arancione ai campioni di vescicole raccolti mediante pellettizzazione diretta attraverso ultracentrifugazione. Il pellet di vescicole risospese è stato esaminato al microscopio elettronico a trasmissione o colorando negativamente campioni con acetato di uranile o osservando sezioni ultrasottili.
La distribuzione e la concentrazione delle dimensioni delle vescicole sono state valutate utilizzando la diffusione dinamica della luce e le analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Le vescicole purificate di Synechocystis sp. PCC6803 sono state separate su un gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide e colorate per i lipopolisaccaridi.
I campioni devono essere prelevati prima e dopo il campione di vescicole concentrato per garantire che la filtrazione a flusso tangenziale funzioni e che le vescicole si concentrino. Quindi è necessario misurare entrambi i campioni utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Sono necessari sforzi futuri per fondere questo metodo con altri approcci come la cromatografia ad esclusione dimensionale o il frazionamento asimmetrico del flusso di campo per migliorare la discriminazione e l'isolamento di piccole particelle da campioni di coltura e ambientali.
Questa tecnica è utile per studiare le vescicole di cianobatteri e i ruoli funzionali specifici di queste vescicole nella biologia cianobatterica.
