Questo protocollo consente un trapianto non invasivo di iPSMG nel cervello di topo immunocompetente combinando l'on/off farmacologico di un antagonista del recettore CSF1 PLX5622 con il trapianto transnasale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che iPSMG può essere trapiantato senza indurre danni cerebrali anche nei topi immunocompetenti. Il trapianto microgliale può servire come potenziale terapia per scambiare microglia disfunzionali con quelle funzionali in varie malattie neurodegenerative in futuro.
A dimostrare la procedura sarà Bijay Parajuli, un ricercatore del mio laboratorio. Inizia scongelando rapidamente le cellule della microglia umana derivate da cellule staminali pluripotenti indotte congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Ruotare i campioni fino a quando tutto il ghiaccio visibile si è sciolto.
Aggiungere l'iPSMG scongelato al terreno di coltura, riscaldato a 37 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di cellule a 10 millilitri di terreni di coltura. Centrifugare le celle a 300 volte g per cinque minuti per ottenere un pellet cellulare.
Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere il mezzo di trapianto per ottenere una concentrazione cellulare di 10 alla quinta cellula per microlitro. Posizionare l'iPSMG sul ghiaccio e procedere immediatamente al trapianto.
Per preparare i topi al trapianto transnasale, nutrire i topi maschi con una dieta contenente PLX per sette giorni. Alla fine del settimo giorno, cessare la dieta PLX e nutrire i topi con una dieta normale. Un'ora prima del trapianto transnasale di iPSMG, somministrare 2,5 microlitri di ialuronidasi in PBS a ciascuna narice due volte utilizzando una punta di pipetta da 10 microliti per aumentare la permeabilità alla mucosa nasale.
Posizionare i topi in posizione supina dopo l'applicazione della ialuronidasi. Somministrare 2,5 microlitri di ialuronidasi dieci minuti prima del trapianto transnasale di iPSMG. Applicare 2,5 microlitri di sospensione cellulare in una narice del mouse utilizzando una punta della pipetta da 10 microlitri.
Posizionare il mouse in posizione supina per cinque minuti prima della somministrazione della sospensione cellulare all'altra narice. Somministrare la sospensione cellulare quattro volte, applicando un volume totale di 20 microlitri per animale. 48 ore dopo la cessazione dell'alimentazione plX, ripetere la somministrazione di ialuronidasi e sospensione cellulare sugli stessi topi.
Per la somministrazione di citochine, applicare 2,5 microlitri del mezzo di trapianto in una narice del topo utilizzando una punta di pipetta da 10 microliti. Dopo due mesi di trapianto transnasale, il numero di cellule trapiantate può essere determinato contando le cellule positive sia per i marcatori specifici per l'uomo che per quelli pan-microgliali. Le microglia di topo endogene sono positive solo per i marcatori pan-microgliali.
Nei topi di controllo, sono state rilevate solo microglia di topo sia nella corteccia che nell'ippocampo. Nella corteccia dei topi trapiantati iPSMG, sono state rilevate solo microglia di topo, mentre nell'ippocampo sono state rilevate iPSMG. Quando si tenta questo protocollo, la rimozione completa del surnatante è essenziale per prevenire la diluizione delle citochine.
È fondamentale applicare citochine ogni 12 ore per la vitalità delle cellule trapiantate. L'esaurimento della microglia di topo endogena è necessario per il trapianto di iPSMG. Questa procedura consente il trapianto di iPSMG in un cervello di topo normale o malato.
Pertanto, è possibile determinare la caratteristica di iPSMG e la risposta alla malattia. Questa tecnica è adatta a determinare la caratteristica in vivo di iPSMG nel cervello del topo. Pertanto, il trapianto di iPSMG in topi modello di malattia ci aiuterà a capire la risposta e potrebbe aprire la strada a un nuovo bersaglio terapeutico.
