L'obiettivo generale del protocollo è quello di isolare le cellule primarie di microglia dai tessuti cerebrali umani adulti vivi. Nel nostro caso, questo è stato raccolto come finestra chirurgica durante l'intervento chirurgico. Questo si ottiene raccogliendo inizialmente i tessuti cerebrali in PBS ghiacciato, il tessuto viene poi tritato in piccoli pezzi di cubo da 1 mm, e l'ho appena fatto con l'aiuto della tripside EDTA.
In seguito, le cellule vengono raccolte per centrifugazione e placcate in un pallone adatto per la coltura cellulare degli androgeni per 48 ore. Le cellule vengono raccolte ancora una volta dal pallone e coltivate fino a un ulteriore utilizzo. Le cellule primarie di microglia umana possono ora essere caratterizzate dall'uso dell'immunocitochimica e utilizzate per ulteriori esperimenti.
Il vantaggio principale del nostro protocollo per isolare le cellule di microglia dai tessuti cerebrali umani adulti è che fornisce efficacemente cellule di microglia umane adulte primarie in modo molto conveniente. Il protocollo è robusto e riduce la perdita di celle riducendo il numero di passaggi utilizzati nei protocolli esistenti. Raccogliere il tessuto in un tubo Falcon da 50 ml contenente 10 ml di ghiaccio freddo aCSF.
Pulire accuratamente il tubo di raccolta con il 70% di alcol e trasferirlo in una camera di flusso d'aria laminare aseptica. Scartare attentamente l'aCSF e pesare il tessuto nel tubo Falcon. Calcola il peso approssimativo del tessuto deducendo il peso del tubo falcon vuoto.
Caldo fresco aCSF a 37 gradi centigradi. Tenere il tessuto in aCSF caldo per cinque minuti. Questo passaggio è fondamentale per evitare la morte cellulare.
Scartare attentamente aCSF. E lavare il tessuto una volta con 1X PBS riscaldato a 37 gradi centigradi. Assicurarsi che tutto il sangue sia lavato via con ripetuti lavaggi PBS in base alle esigenze.
Incubare il tessuto in PBS caldo per 5 minuti. Scartare con attenzione metà del PBS. Trasferire il tessuto insieme al PBS rimanente in una piastra di Petri sterilizzata.
Rimuovere con cura il PBS rimanente con pipetta da 1 mL. Ciò impedirà la perdita di tessuto. Dadi che esentrano in almeno 1 mm cubo piccoli pezzi usando un bisturi sterile.
Aggiungere 2 mL di 0,25% di tripside EDTA alla piastra di Petri e lavare accuratamente la piastra con l'aiuto di pipetta. Trasferire il tessuto a dadini in un tubo Falcon da 50 ml contenente 10 ml per grammo di tessuto dello 0,25% di tripside EDTA. Mescolare pipettando attraverso una pipetta sierologica da 10 mL.
Incubare il tubo su uno shaker per 30 minuti a 37 gradi centigradi e la velocità di 250 giri/min. Aggiungere 10 mL di mezzo neutralizzante per neutralizzare la tripside. Mescolare accuratamente con una pipetta sierologica da 10 mL.
Centrifugare il tubo a 2000G a 4 gradi centigradi per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di mezzo di coltura. Posare le cellule in un pallone T25 adatto per le cellule androgene e aggiungere 4 ml di mezzo di coltura aggiuntivo.
Il mezzo di coltura conterrà il 20%L929 supernatante e l'1%streptomicina. Si consiglia di aggiungere separatamente il supernatante L929 in fiasche invece di aggiungere al mezzo di coltura stock. Abbiamo finito con il pallone per smaltire in modo omogeneo il tessuto.
Evitare di portare il supporto al collo del pallone mentre si trema in quanto ciò può aumentare le possibilità di contaminazione. Incubare il pallone a 37 gradi centigradi con il 5%CO2 per 48 ore. Raccogliere i supporti dal pallone da coltura T25 preparato il giorno 0 in tubi di centrifuga.
Centrifuga i supporti raccolti a 1.466G a 4 gradi centigradi per 4 minuti. Mentre il supporto raccolto viene centrifugato, lavare il pallone giorno 0 una volta con 1X PBS. Agitare delicatamente il pallone per rimuovere eventuali frammenti di tessuto residuo rimasti.
Evitare dure scosse del pallone in quanto eventuali frammenti remnant non influenzeranno negativamente la coltura. Aggiungere 5 ml di mezzi di coltura freschi al pallone. Scartare il supernatante dai tubi centrifugati.
Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura a uno dei tubi e mescolare accuratamente con pipetta. Aggiungere in serie il supporto misto con le celle ad altri tubi e mescolare accuratamente. Posare le cellule in un pallone T25 separato adatto per le cellule androgene.
Aggiungere 4 ml di mezzi di coltura freschi al pallone. Incubare entrambi i contenitori a 37 gradi centigradi con 5%CO2 per 48 ore. Scartare i supporti da entrambi i contenitori e aggiungere nuovi supporti di coltura da 5 mL.
Incubare i contenitori a 37 gradi centigradi al 5%CO2 per 48 ore. Il sesto giorno, le cellule saranno pronte per ulteriori esperimenti. Nelle immagini qui rappresentate.
Primo pannello della sezione A astrociti macchiati di GFAP, di colore verde. Nel secondo pannello, della sezione A microglia macchia con RCA, di colore verde. Nella sezione B microglia macchiata di RCA, di colore verde, e gli astrociti sono macchiati di GFAP, di colore rosso.
La sovrapposizione delle immagini mostra microglia e astrociti insieme. Dalle immagini è chiaro che la maggior parte delle cellule nella coltura preparata sono microglia. Le immagini sono state quantificate da un controllo accecato e il risultato è rappresentato nella sezione C.I risultati hanno mostrato che circa l'80% delle cellule nella coltura preparata sono cellule di microglia.
Questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora e mezza. Seguendo questa procedura dovrebbe avere una buona comprensione di come faccio a selezionare le microglia di adescamento dai tessuti cerebrali umani adulti, che possono essere ulteriormente utilizzati per esperimenti a valle.
