Questo protocollo facilita l'uso di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umani per applicazioni di screening ad alto contenuto. È particolarmente adatto per il dosaggio delle sinapsi, che nei neuroni umani richiedono lunghi periodi di coltura. Dimostriamo la ripiazzamento dei neuroni da piatti di grande formato in multi pozzi compatibili con HCS in modo da preservarne la vitalità.
In modo controintuitivo, mostriamo che estendere l'incubazione della proteasi prima di riutilizzare e rimpiazzarsi produce una migliore sopravvivenza neuronale. I neuroni derivati dalle cellule staminali pluripotenti umane sono sempre più rilevanti nelle aree della ricerca di base, dello sviluppo di farmaci e della medicina degenerativa. Questo delicato metodo di titolazione può essere utilizzato per rimostrare qualsiasi grande monostrato di cellule con una fitta rete di processi.
Oltre agli iPSC umani, può essere usato per rispacciare la coltura dei neuroni primari o per risospeserli per lo smistamento dei fatti o il sequenziamento di singole cellule. È importante seguire attentamente i passaggi dei protocolli e monitorare frequentemente il distacco mediato della proteasi dei neuroni dalla piastra. Il tempo di incubazione ottimale può variare, a seconda della coltura.
La dimostrazione visiva consente anche agli investigatori inesperti di riprodurre questa procedura. Iniziare risciacquando delicatamente la piastra dei neuroni differenziati con PBS. Disperdere il PBS lungo la parete della piastra e non direttamente sulle cellule per evitare di interromperle.
Aspirare il PBS dal bordo del piatto mentre lo si ribalta, facendo attenzione a non toccare le cellule. Applicare almeno un millilitro di enzima proteolitico per piastra di 10 centimetri. E riportare le cellule nell'incubatrice per 40-45 minuti.
Durante l'incubazione, controllare i neuroni su un microscopio a contrasto graduale e continuare il trattamento proteasi fino a quando la rete neurale si stacca completamente dalla piastra e inizia a rompersi. Quando i neuroni si sono staccati, interrompere la digestione aggiungendo cinque millilitri di supporti DEMEM freschi per ogni millilitro di proteasi. Utilizzare una pipetta sierologica per titolare delicatamente le cellule contro la piastra da cinque a otto volte, assicurandosi di non applicare troppa pressione.
Filtrare le cellule attraverso una rete da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri, goccia a goccia. E sciacquare il colino con altri cinque millilitri di supporti DMEM freschi. Utilizzare una centrifuga da banco per far girare le cellule verso il basso a 1000 volte G per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, riportare il tubo conico nell'armadio di biosicurezza e aspirare la maggior parte dei supporti, lasciando 250 microlitri per mantenere le cellule umidi. Rimorsiva delicatamente le cellule in due millilitri di supporti DMEM freschi, quindi passarle attraverso la fine di una pipetta sierologica da cinque millilitri. Infine, invertire il tubo da due a tre volte.
Usa un emocitometro e un blu tripano per contare le cellule vitali. E poi DMEM alla concentrazione desiderata. Aggiungere appositi integratori al tubo, a seconda delle esigenze della linea cellulare specifica e mescolare delicatamente le cellule inclinando il tubo conico da due a tre volte.
Aspirare il rivestimento di laminina da una piastra da 24 po 'e sciacquarlo una volta con PBS. Aspirare il PBS. E applicare la soluzione cellulare a ciascun pozzo in una figura di otto movimento per evitare di grumi.
Al termine della placcatura delle cellule, riportare la piastra all'incubatore impostata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Vortice brevemente la soluzione stock del primo reporter della morte cellulare e aggiungerlo ai pozzi secondo le indicazioni del manoscritto. Aspetta 20 minuti.
E poi immagini le cellule vive e morte su più pozzi con fondo di vetro. Prolungare l'incubazione della proteasi consente l'allentamento della rete neuronale all'interno del foglio di cellule sollevato. Ciò si traduce in una ridotta morte cellulare al momento della dissociazione e si traduce in un recupero più efficiente nei giorni successivi.
Usando la procedura di incubazione enzimatica estesa, le colture mostrano un raddoppio approssimativo della vitalità cellulare durante i giorni dopo la riposizione e una minore densità di cellule morte o morenti. La fase di transizione della differenziazione neuronale avviene in diversi giorni, durante i quali le cellule esprimono gradualmente marcatori neuronali in fase avanzata. Questi marcatori vengono immediatamente rilevati in colture che sono state tardivamente dopo quattro settimane di pre-differenziazione.
Il protocollo proteasi esteso migliora anche moderatamente la crescita del neuride. Sia la lunghezza totale del neuride che la crescita della dendrite sono migliorate. Il rimpiazzamento è utile anche per studiare le sinapsi.
Solo una settimana dopo la ripiazza, sono stati osservati marcatori per proteine pre e post-sinaptiche. Inoltre, l'attività elettrica da depolarizzazione spontanea e correnti sinapticamente guidate è rilevabile utilizzando l'imaging del calcio o array multielettrodi. Questa procedura di ripiazzatura può essere adattata a molti tipi di applicazioni.
Oltre allo screening ad alto contenuto per identificare potenziali composti terapeutici, potrebbe essere utilizzato per l'imaging di coni di crescita o registrazioni di array multielettrode. La dissociazione meccanica dei neuroni che hanno già formato processi lunghi è stressante. L'incubazione enzimatica allungata e la delicata titolazione delle cellule sono passaggi essenziali per il successo di questa procedura.
