Questo protocollo permette di studiare il potenziale e la capacità della glia di Muller di convertirsi in cellule progenitrici retiniche dopo il trattamento con fattori specifici come i microRNA. Il vantaggio di questa tecnica è che i candidati microRNA possono essere testati per la loro efficienza e risultato prima del loro utilizzo in applicazioni in vivo. Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Seoyoung Kang, una dottoranda del laboratorio di Stefanie Wohl.
In primo luogo, immergere brevemente il bulbo oculare rimosso in un tubo con etanolo per evitare il trascinamento di batteri dall'animale. Quindi, lavare brevemente il bulbo oculare nella capsula di Petri da 10 centimetri prima di posizionarlo nella piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio. Una volta rimossi e puliti i bulbi oculari, posizionare un occhio nel piatto di dissezione posto sotto un microscopio da dissezione con una fonte di luce.
Ora fissa un bulbo oculare afferrando il nervo ottico e il tessuto connettivo circostante intorno alla sclera con una pinza fine Dumont 5 e premerlo con attenzione contro il piatto di dissezione. Successivamente, praticare un foro nel centro della cornea utilizzando un ago calibro 30 per consentire un accesso più facile alle forbici venose. Quindi, sezionare la cornea intorno al corpo ciliare usando le forbici venose e rimuovere con attenzione la cornea, la lente, l'iride e il corpo vitreo con una pinza fine Dumont 5.
Successivamente sezionare la sclera con le forbici venose fino a raggiungere il nervo ottico ed estrarre con cura la retina usando una pinza fine Dumont 5. Ora usa una seconda pinza fine Dumont 5 per spingere contro la retina e rimuovere completamente il corpo vitreo. Trasferire le retine tagliate circa 2,5 centimetri della punta di una pipetta di trasferimento sterile per ingrandirne il diametro.
Ora, usando questo suggerimento, raccogli intere retine senza danneggiare il tessuto e trasferisci le retine in una nuova capsula di Petri sterile con HBSS freddo e scuoti il piatto. Successivamente, utilizzando una nuova pipetta di trasferimento sterile, spingere con attenzione le retine per lavare via le cellule epiteliali pigmentate retiniche. Posizionare immediatamente la retina isolata in un nuovo pozzetto pulito della piastra a 24 pozzetti riempita con un millilitro di HBSS mantenendo la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio durante la dissezione.
Preparare la miscela di dissociazione della Papaina DNasi I come descritto nel manoscritto. Ora con una pipetta di trasferimento della punta allargata, raccogliere le retine. Attendere che le retine si depositino nella parte inferiore della punta e rilasciare le retine senza eccessiva HBSS nel tubo contenente la miscela di Papaina DNasi I.
Quindi, posizionare il tubo su un nutator nell'incubatore e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius e con il 5% di anidride carbonica. Quindi, dissociare le cellule con attenzione pipettaggio su e giù con una pipetta da un millilitro. Dopo che le cellule sono state dissociate, aggiungere 275 microlitri di inibitore della proteasi ovomucoide dal kit di dissociazione della papaina per neutralizzare la papaina e mescolare delicatamente pipettando su e giù.
Mettere i tubi in una centrifuga e ruotare a quattro gradi Celsius per otto minuti con una forza centrifuga relativa di 300. Aggiungere il fattore di crescita epidermico al volume calcolato del terreno di crescita preriscaldato a 37 gradi Celsius. Rimuovere accuratamente i tubi dalla centrifuga.
Senza toccare il pellet sul fondo del tubo, rimuovere il surnatante con cura e interamente. Ora risospendi il pellet cellulare con 500 microlitri di mezzo di crescita integrato con fattore di crescita epidermico. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti etichettata.
Risciacquare il tubo con altri 500 microlitri del mezzo di crescita integrato con fattore di crescita epidermico e aggiungerlo al pozzetto. Scuotere attentamente la piastra del pozzo, quindi posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica. Inizia controllando la confluenza cellulare dal 90% al 100%.
Quindi, rimuovere il mezzo e aggiungere un millilitro di HBSS freddo per lavare il pozzo. Oscillare delicatamente la piastra e rimuovere HBSS senza lasciare tracce. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di una soluzione contenente tripsina preriscaldata per staccare le cellule dal pozzetto.
Oscillare delicatamente e incubare per due minuti in incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo aver spostato la piastra dall'incubatore all'armadio di biosicurezza, aspirare la soluzione contenente tripsina durante l'inclinazione. Disperderlo con cura e lentamente sul pozzo più volte fino a quando le cellule si staccano completamente.
Quindi, trasferire questa sospensione cellulare in un tubo sterile da 1,5 millilitri e inserire i tubi nella centrifuga. Girare a 300 volte g per otto minuti a quattro gradi Celsius e riportare i tubi nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere il surnatante senza toccare il pellet.
Ora risospendere attentamente il pellet cellulare aggiungendo 600 microlitri di terreno di crescita preriscaldato e pipettando su e giù circa 30-40 volte. Infine, seminare 100 microlitri della sospensione cellulare ottenuta al centro di sei vetrini di copertura rivestiti della piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra sull'incubatore e lasciare che le cellule si depositino per la successiva trasfezione usando micro RNA mimiche.
La figura mostra le condizioni di controllo cinque giorni dopo la trasfezione con alcune cellule positive al pomodoro Ascl1. Dopo un trattamento miR-25, tuttavia, si trovano molte più cellule positive al pomodoro Ascl1. La quantificazione ha rivelato un aumento di quattro volte del numero di cellule positive al pomodoro Ascl1 nei pozzetti trattati con miR-25 rispetto ai controlli.
Ancora più importante, la stragrande maggioranza delle cellule positive al pomodoro Ascl1 trovate nei pozzetti trattati con riR-25 ha adottato una morfologia neuronale. Le caratteristiche di questa morfologia neuronale includevano la riduzione delle dimensioni del soma cellulare, lo sviluppo di processi fini e la formazione di piccole reti. La quantificazione ha rivelato che circa il 70% di tutte le cellule positive al pomodoro Ascl1 aveva caratteristiche neuronali.
La marcatura immunofluorescente mostra che le cellule positive al pomodoro Ascl1 con morfologia neuronale esprimono i marcatori neurali OTX2 e MAP2, confermando l'identità neuronale. La quantificazione di queste cellule ha rivelato che dopo la sovraespressione di miR-25, sono presenti circa 40 neuroni positivi all'Ascl1-Tomato per campo rispetto a cinque cellule neuronali per campo nei controlli. Le cellule neuronali identificate costituiscono circa il 70% della popolazione totale di cellule positive al pomodoro Ascl1 dei campioni trattati con miR-25.
Inoltre, la quantificazione del numero assoluto di neuroni coesprimenti OTX2 e MAP2 ha mostrato che dopo il trattamento con miR-25, sono stati trovati circa 60 neuroni per campo rispetto ai 10 neuroni per campo nei controlli. È imperativo lavorare in un ambiente pulito e igienizzato con strumenti puliti e sterili e lavorare con attenzione evitando qualsiasi trattamento duro. Le applicazioni a valle possono essere, ad esempio, la quantificazione delle proteine, l'analisi del DNA o dell'RNA o studi elettrofisiologici.
Questa tecnica ci ha aiutato a esplorare le domande iniziali sulla riprogrammazione nucleare che appartiene al campo della medicina rigenerativa. E c'è una lunga gamma di fattori e condizioni che possono essere testati per esplorare nuove domande.
