Questo lavoro è stato supportato da NIH grant R01 GM113602 (WFM) e NSF 1144247 (AL). Riconosciamo che Mark Slabodnick e Natalie Kirkland per sviluppare le versioni iniziali di alcuni di questi protocolli e le discussioni ben informative. Ringraziamo Karina Perlaza e Greyson Lewis per lettura critica del manoscritto.

<ol>
	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Coltura Stentor presenta una serie di sfide. In primo luogo, per eseguire esperimenti che richiedono un numero elevato di cellule, uno ha bisogno di mantenere un gran numero di culture Stentor , come culture diventare malsane quando Stentor concentrazione supera 20 cellule/mL. In secondo luogo, gli organismi che possono contaminare Stentor culture spesso dividono più veloce di Stentor e sopraffare la cultura (un agente inquinante comune è rotiferi). Pertanto, è necessario controllare periodicamente la cultura sotto un microscopio e rimuovere i contaminanti. Occasionalmente, una nuova cultura deve essere avviato da un piccolo numero di cellule salvato manualmente da una cultura contaminata. Questo aumenta il tempo necessario per mantenere sano Stentor culture. In terzo luogo, espandendo una singola cella in una cultura di 400 mL richiede almeno un mese perché Stentor ciclo cellulare è 3-5 giorni. In quarto luogo, a differenza di altri modello ciliati, Stentor raramente andare in forma cistica ed essi non possono essere congelati.
Un aspetto importante della coltura Stentor è la selezione di un organismo di alimentazione adeguata. Precedentemente sono stati descritti vari metodi per la coltivazione Stentor . Uno di loro suggerisce di utilizzare latte scremato ai batteri di cultura che alimentano poi Stentor. Tale tecnica è efficace in coltura Stentor; Tuttavia, l'applicazione di tecniche genomiche richiede campioni puri per evitare confusione derivanti dalla genomiche letture da organismi non definito cibo. Utilizzando il protocollo attuale, Stentor può essere coltivata in massa e, perché il loro cibo, Chlamydomonas, è stato sequenziato, la presenza di contaminazione genomico dall'organismo dell'alimento possa essere rilevata e controllata per. Per ragioni sconosciute, tartaro dovuto ricostituire le sue scorte di ritornare dove trovò Stentor prima. Con il protocollo attuale, siamo stati in grado di mantenere Stentor per anni.
Esperimenti di rigenerazione con Stentor sono generalmente semplici, ma ci sono alcuni dettagli critici da tenere a mente. Per quanto riguarda la sezione 2, taglio Stentor cellule a metà possono essere masterizzate in pochi minuti. Mastering più avanzate procedure di microchirurgia di Stentor possono richiedere una settimana di pratica. Mentre effettuando un trattamento di saccarosio o urea (sezione 3), se all'inizio dell'imaging la maggior parte delle cellule hanno ancora loro bande membranellar, aumentare il tempo di incubazione di 10-30 s per quando saccarosio trattamento viene eseguito successivamente. Non aumentare il tempo di trattamento di saccarosio di là di incubazione 3 min perché il risultato sarà la morte delle cellule.
Imaging di Stentor rigenerazione richiede metodi di grandi cellule di immagine per lunghi periodi di tempo. Il metodo di imaging dettagliato nella sezione 4 è utilizzabile solo con un microscopio dritto. Se invece è disponibile un microscopio invertito, cellule posizionabile su una diapositiva o un vetrino coprioggetti in piccole camere. Un metodo è quello di creare una camera fuori di vaselina e coprire con un altro vetrino coprioggetto per evitare l'evaporazione. In alternativa, una camera per una singola cella può essere fatto facendo un buco con un punzone di foro della dimensione desiderata in un 1 x 1 cm2 quadrati di distanziatore di silicio (tabella materiali), posizionare il distanziale su un vetrino coprioggetti, mettendo le cellule nella camera e che copre la camera con un altro vetrino coprioggetti. Quando imaging, se Stentor non sono con l'orientamento corretto per osservare le caratteristiche di ogni fase di rigenerazione, picchiettare con decisione per rendere il contratto di cella. Guarda la cella estendere per identificare la fase di rigenerazione (estensione completa richiede circa 45 s). Se la cella è ancora nell'orientamento sbagliato, ripetere il tapping. Le immagini mostrate nella Figura 1 e Figura 6 sono state scattate da un microscopio stereo zoom; Tuttavia, tutti gli esperimenti dettagliati possono essere eseguiti utilizzando un 5 X stereo microscopio per dissezione.
Un'altra sfida oltre a coltura e imaging Stentor è il monitoraggio della rigenerazione, in particolare la quantità di tempo necessario per identificare le fasi. Se la cella rigenerante è perfettamente orientata con la regione del primordio orale chiaramente visibile, identificazione della fase richiede pochi secondi. A volte, tuttavia, la cella Stentor è in un orientamento prevenzione chiara assegnazione della fase di rigenerazione, tenendo così più tempo per identificare. La notevole quantità di tempo necessario alla fase di singole celle rigenerante potrebbero ritardare la quantificazione di tutte le cellule rigenerante, diminuendo così la precisione temporale della messa in scena e che richiedono l'osservatore ad aspettare e ricreare l'immagine la cella dopo esso ha spostato a un nuovo orientamento. Di conseguenza, questo esperimento è sia di tempo che di alta intensità di manodopera. Per questi motivi, sarebbe altamente auspicabile sviluppare metodi automatici per la rilevazione di cellule Stentor e assegnazione fasi di rigenerazione in dati video microscopia. Questi consentirebbe anche per ulteriori esperimenti riproducibili, aumenta la dimensione del campione e la rimozione dei pregiudizi umani.
L'emersione dei metodi altamente sensibili di genomica e proteomica ha cominciato a mettere gli studi delle singole cellule in reach. Per tali analisi unicellulare, il formato gigante di una cella Stentor rende auspicabile cavia per esperimenti di proof-of-concept. Per tali esperimenti essere possibili, coltura Stentor è fondamentale, e quindi i metodi descritti qui dovrebbero giocare un ruolo in ulteriore sviluppo delle tecniche più avanzate di cella singola.

Le cellule non sono semplici sacchetti di enzimi, ma piuttosto altamente complesse macchine i cui componenti sono accuratamente adattate alla dimensione corretta e disposti in posizioni ben definite. La morfogenesi delle cellule individuali rappresenta un processo chiave nella cellula e biologia dello sviluppo, ma il suo meccanismo molecolare è sconosciuto1,2. Mentre alcune cellule coltivate assomigliano a BLOB, organismi unicellulari possono estremamente complicato architetture, esemplificati dal complessi corticali modelli visti nelle ciliati3,4.
Forse l'esempio più estremo di una cellula altamente strutturata è Stentor coeruleus, un gigante heterotrichous ciliato in tiepidi Tetrahymena e Paramecium . Stentor è lungo 1 mm ed è coperto con più di 100 strisce longitudinali di pigmento blu alternate a righe di ciglia organizzato da stack in parallelo dei nastri dei microtubuli che corrono la lunghezza dell'intera cella. La cella è a forma di tromba (Figura 1), con una banda di membranellar e un apparato orale (OA) alle sue estremità anteriore e un peduncolo che si collega il cellulare al substrato alla sua estremità posteriore. Oltre la polarità chiaro antero-posteriore, la cella indica un distintivo patterning chirali, tale che la spaziatura tra righe ciliare gradualmente aumenta in senso orario. Questo si traduce in una discontinuità dove la riga più stretta incontra la riga più ampia e questa regione della superficie delle cellule, noto come il locus di contrasto striscia, può indurre la formazione del secondo set di strutture di estremità anteriore quando si innesta su un'altra cella5, rendendola formalmente equivalente all'organizzatore di Spemann. Così, tutti i processi chiave della biologia dello sviluppo hanno loro analoghi in Stentor: axiation, formazione di pattern e induzione. In un embrione, questi processi sono guidati da differenze di destino fra le diverse cellule, ma in Stentor, essi devono essere guidati da differenze di destino tra le diverse regioni all'interno di una singola cella. Ciò che definisce le differenze tra le regioni all'interno di Stentor è un mistero.
Se qualsiasi parte di Stentor è tagliato fuori, il pezzo mancante della cella può rigenerare per produrre una cellula normale in una questione di ore. Se una cella è tagliato a metà, o anche a pezzetti molto piccoli, ogni pezzo riorganizza in una cella di aspetto normale, ma più piccola e ripristina la proporzionalità tra cella parti6,7. Anche piccolissimi frammenti, 1/64th la dimensione della cella originale, sono in grado di rigenerare in una cella piccola ma normalmente proporzionata e quindi crescere per il full-size6. Stentor presenta dunque un'opportunità unica di studiare i meccanismi organello dimensione delle cellule e ridimensionamento della regolazione della crescita con metodi chirurgici che solitamente vengono applicate a livello di tessuti o interi organismi.
Una delle proprietà di Stentor che permette di rigenerare da una vasta gamma di operazioni chirurgiche è che contiene un macronucleo singolo nodulated (Figura 1) con circa 50.000 copie del genoma intero8. Come un frammento di cella contiene almeno un nodo macronuclear, ha la capacità di rigenerare completamente. Un'altra proprietà che sono alla base di Stentorabilità di rigenerazione è la sua capacità di guarigione prodigiosa. Anche se molti tipi delle cellule sono in grado di guarire le loro ferite9, Stentor è in grado di recuperare da una straordinaria gamma di perturbazioni fisiche. Un esempio di recupero Stentor da una perturbazione drastica, insieme ai metodi per visualizzare flusso citoplasmatico in Stentor10 precedentemente sono stati segnalati. Questi metodi consentono lo studio di come ferimento e successiva rigenerazione influenzano lo stato fisico del citoplasma.
Stentordi enormi dimensioni, capacità di rigenerazione straordinaria e il fatto che si manifesta molti dei fenomeni dello sviluppo visti in embrioni multicellulari (quali gli organizzatori, axiation e patterning) ha attirato molti biologi inerente allo sviluppo durante la girata del secolo scorso, tra cui Thomas Hunt Morgan7. Durante gli anni ' 50 e ' 60, approcci microsurgical hanno dimostrato una sorprendente gamma di processi rigenerativi e morfogenetici in questo organismo unicellulare11. Tuttavia, Stentor è stato sviluppato come un sistema di modello di biologia molecolare solo recentemente. Nel corso degli ultimi anni, il genoma di Stentor è stato sequenziato e assemblato8, e il metodo per perturbare l'espressione genica mediante l'alimentazione di RNAi è stato sviluppato12.
Uno dei motivi che Stentor è stato sviluppato in un organismo modello per la biologia molecolare moderna solo recentemente è stato la difficoltà di crescere grandi culture a causa di un lungo ciclo di cella (3-5 giorni). Tuttavia, i metodi moderni di genomica e proteomica richiedono meno materiale che hanno usato per, e il volume di una singola cella di Stentor è sufficiente per questi metodi, anche senza ricorrere a metodi ultrasensibili che sono stati sviluppati per l'analisi del singolo cellule che sono molto più piccole di Stentor. Sezione 1 del protocollo in dettaglio la procedura per la creazione di una grande cultura da una singola cellula Stentor . Lo stesso approccio può essere utilizzato per stabilire una grande cultura da un frammento di cellule ottenuta dal taglio di una cella. Sezione 1, inoltre, fornisce le linee guida per il mantenimento sano Stentor culture per lunghi periodi di tempo. Sezione 2 del protocollo fornisce la metodologia per indurre la rigenerazione delle cellule tagliando le celle manualmente con un ago di vetro. Sezione 3 del protocollo è dedicato ai due metodi di indurre la rigenerazione delle strutture cellulari specifici (membranellar band e orale apparato): trattando le cellule con saccarosio o urea conduce allo spargimento di queste strutture, seguite da loro rigenerazione. Sezione 4 del protocollo in dettaglio un metodo per l'imaging di singole celle rigenerante per lunghi periodi di tempo. Sezione 4 si conclude con la descrizione delle fasi di rigenerazione e suggerimenti sull'analisi delle dinamiche di rigenerazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus live culture</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>131598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas reinhardtii on agar</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>152040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>132458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, 1500 cP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex glass spot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>715740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cup glass container with glass lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1095600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CultureWell silicone sheet material</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Fisher finest</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1379801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td>
			<td>Grace Bio Labs</td>
			<td>664475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>P1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes. 
			OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B120-90-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller P-87</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the study of regeneration in stentor

Le cellule hanno bisogno per essere in grado di rigenerare le parti per recuperare da perturbazioni esterne. Il ciliato unicellulare Stentor coeruleus è un organismo modello eccellente per studiare la guarigione della ferita e la rigenerazione delle cellule successive. Il genoma di Stentor è diventato disponibile recentemente, insieme ai metodi di biologia molecolare moderna, ad esempio RNAi. Questi strumenti rendono possibile studiare unicellulare rigenerazione a livello molecolare. La prima sezione del protocollo copre che stabilisce Stentor colture di cellule da singole cellule o frammenti di cellule, insieme a linee guida generali per il mantenimento Stentor culture. Stentor la coltura in grandi quantità consente l'utilizzo di strumenti preziosi come biochimica, sequenziamento e spettrometria di massa. Le sezioni successive del protocollo coprono diversi approcci per indurre la rigenerazione in Stentor. Manualmente taglio cellule con un ago di vetro permette di studiare la rigenerazione di parti di grandi cellule, mentre trattando le cellule con saccarosio o urea permette di studiare la rigenerazione delle strutture specifiche sull'estremità anteriore della cella. Viene fornito un metodo per le immagini singole celle rigenerante, insieme a una rubrica per sosta e analizzare la dinamica della rigenerazione. L'intero processo di rigenerazione è diviso in tre fasi. Visualizzando la dinamica della progressione di una popolazione di cellule attraverso le fasi, è dimostrato l'eterogeneità nei tempi di rigenerazione.

Stentor culture sono state stabilite in modo affidabile e mantenute da singole celle o frammenti di cellule utilizzando la sezione 1 del protocollo. Un esempio rappresentativo di una grande cultura sana è mostrato nel Video 1.
Il corso di tempo di rigenerazione è stato misurato in Stentor utilizzando il metodo di trattamento di saccarosio per l'avvio di rigenerazione descritta nel passo 3.1, combinato con l'imaging e il metodo di analisi descritto nella sezione 4 (Figura 7). Questo grafico indica che c'è una diffusione di uno-ora-lungo del tempo impiegato dalla popolazione delle cellule di raggiungere qualsiasi particolare fase. Questo tipo di analisi permette lo studio dell'eterogeneità temporale nel processo di rigenerazione in una popolazione di rigenerazione delle cellule.
Di seguito è riportato un riepilogo dei tempi di rigenerazione che sono stato osservato finora dopo decine di trattamenti di saccarosio (Figura 4 e Figura 6). Fase 1 è quando Stentor cellule sembrano lacrime senza qualsiasi banda di membranellar (questa fase inizia immediatamente dopo l'interruzione di saccarosio). Questa fase dura per 3-6 h. fase 2 è quando una banda di membranellar apparirà e cresce (3-6 h dopo il trattamento di saccarosio). Questa fase dura per 3-4 h. Stage 3 è quando un primordio orale viene visualizzato all'estremità posteriore della band membranellar (6-8 h dopo il trattamento di saccarosio), entrambe le strutture vengono spostate verso l'estremità anteriore della cella. Questa fase dura per 1-2 h. Quando la band di membranellar sia l'apparato orale ha raggiunto l'estremità anteriore della cella, questo indicato il completamento della rigenerazione. La cella ha adottato caratteristica Stentor tromba-come forma. Le cellule erano completamente rigenerati 8-9 h dopo il trattamento di saccarosio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> Figura 1. Istantanea di Stentor. La band membranellar e apparato boccale è mostrato all'estremità anteriore della cella. Il peduncolo è all'estremità posteriore della cella. Stentor macronucleo è nodulated. Un ben nutrito Stentor ha verdi vacuoli alimentari contenenti principalmente Chlamydomonas. Barra della scala è di 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Figura 2. Set-up taglio Stentor . Il taglio delle cellule avviene modificando manualmente un ago di vetro mentre guardando la cella utilizzando un microscopio stereo da dissezione commercialmente disponibile. Lo scopo della carta è quello di fornire lo sfondo bianco per vedere le cellule meglio. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> Nella figura 3. Istantanee di 3 Video che illustra come tagliare un Stentor con un ago di vetro. (A) A Stentor immediatamente prima l'ago tocca. (B) un Stentor spremuto leggermente tra una diapositiva di ferro e vetro. (C) A contratto Stentor reagire alla forza dell'ago. (D) A Stentor taglianda premendo delicatamente sulla cella con il lato dell'ago. (E) A Stentor ora tagliata in due, ma non separati. (F) due Stentor frammenti. Barra della scala è di 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Figura 4. Visualizzazione schematica della sezione 3 e sezione 4 del protocollo. Si tratta di un protocollo illustrato per l'esecuzione di saccarosio o urea trattamento e l'osservazione di rigenerazione delle cellule. Il tempo indicato nel pannello inferiore è misurato dall'inizio del lavaggio 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Figura 5. Il programma di installazione per l'osservazione diretta e/o formazione immagine di rigenerazione con un microscopio dritto. In ogni goccia di 4 µ l appesi il vetrino coprioggetto, c'è una cella in fase di rigenerazione. Acqua nei pozzetti della piastra spot vetro limita l'evaporazione delle goccioline. Questa configurazione permette dopo la rigenerazione delle cellule multiple in parallelo. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> Nella figura 6. Istantanee di Stentor in ogni fase della band membranellar e la rigenerazione dell'apparato orale. (A) fase 1 è caratterizzata da una forma a goccia-tipo delle cellule e l'assenza della band membranellar. (B) fase 2 è caratterizzato dalla comparsa della membranellar band, una struttura basata su ciglia che batte continuamente. Membranellar bande sono contrassegnati con linee bianche tratteggiate nei pannelli B - D. (C e D) fase 3 è caratterizzata dalla comparsa di primordio orale (contrassegnato con una freccia). Orale primordio appare come un'invaginazione all'estremità posteriore della band membranellar. Il primordio orale si muoverà quindi verso l'anteriore della cellula per diventare l'apparato orale. (E) rigenerazione viene completata quando la cella ha adottato la caratteristica forma a tromba Stentor , e apparato boccale (contrassegnato con una freccia) si è allargato all'estremità anteriore della cella. Barra della scala è di 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Figura 7. Impilati visualizzando trama scatola come proporzioni delle cellule in tutte le fasi di rigenerazione dopo il trattamento di saccarosio cambia nel passare del tempo. Il grafico mostra eterogeneità nella sincronizzazione delle fasi di rigenerazione all'interno di una popolazione di cellule rigenerante. "Numero di registrazione fine" indica il completamento della rigenerazione. Il numero di celle: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Video 1. Esempio di una sana cultura Stentor . In genere, se una cultura è questo concentrato, spaccare la cultura è raccomandato. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Video 2. Rallentare Stentor con metilcellulosa. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Video 3. Taglio Stentor. Singole celle possono essere tagliate manualmente in più parti sotto uno stereo microscopio per dissezione premendo un ago di vetro attraverso la cella. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema con la cultura</td>
			<td>Possibile rimedio</td>
			<td>Prevenzione possibile</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura è sopraffatto da rotiferi o altri organismi di grandi dimensioni.</td>
			<td>Rimuovere altretante Stentor possibili in una nuova piastra di coltura. Quindi lavare le cellule tre volte.</td>
			<td>Lavare accuratamente Stentor quando riceverli, anche quando li acquista da un fornitore commerciale.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura è sopraffatto da funghi o altri piccoli organismi.</td>
			<td>Identificare un angolo dove ci sono meno Stentor. In quella zona, rimuovere tanto mezzi possibili senza rimuovere molti Stentor e aggiungere nella nuova PSW. Mescolare delicatamente ma accuratamente per distrubuire gli organismi invasori. Saltare l'alimentazione successiva e Stentor li mangerà.</td>
			<td>Osservare la cultura regolarmente e rimuovere piccoli contaminanti attraverso lo scambio di supporti per PSW fresco.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor stanno ponendo in cima a vicenda.</td>
			<td>Dividere la cultura in modo che la concentrazione è inferiore a 20 cellule/mL.</td>
			<td>Dividere culture più spesso.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor cellule sono accoppiamento.</td>
			<td>Alimentazione ogni 4 giorni invece di ogni 5 giorni.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>La cultura ha un sacco di materiale di scarto scuro.</td>
			<td>Rimuovere la maggior quantità di materiale scuro, Stentor rifiuti, possibile senza rimuovere le cellule. Se Stentor sono attaccati al materiale scuro, pipettare su e giù per rilasciare le cellule Stentor dai loro rifiuti e quindi rimuovere il supporto con i rifiuti senza rimuovere le cellule. O, rimuovere quelli Stentor e mangimi di conseguenza meno.</td>
			<td>Alimentazione Stentor 1ml meno cibo per 100 mL di cultura.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dall'aspetto malsano (vacuolato/gonfio o arrotondati) Stentor.
</td>
			<td>Rimuovere tanto mezzi possibili senza rimuovere molti Stentor celle e aggiungere nuova PSW.</td>
			<td>Scambiare i media regolarmente.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Guida alla risoluzione dei problemi per la coltura Stentor.

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Il gigante ciliati, Stentor coeruleus, sono un ottimo sistema per studiare la rigenerazione e la guarigione delle ferite. Vi presentiamo le procedure per stabilire colture cellulari Stentor da singole cellule o frammenti di cellule, inducendo la rigenerazione di cellule di taglio, chimicamente che inducono la rigenerazione della banda membranellar e apparato orale, imaging e l'analisi della cella rigenerazione.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.6K Views.  University of California San Francisco. Il gigante ciliati, Stentor coeruleus, sono un ottimo sistema per studiare la rigenerazione e la guarigione delle ferite. Vi presentiamo le procedure per stabilire colture cellulari Stentor da singole cellule o frammenti di cellule, inducendo la rigenerazione di cellule di taglio, chimicamente che inducono la rigenerazione della banda membranellar e apparato orale, imaging e l'analisi della cella rigenerazione.

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Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Ablazione specifiche Hepatocyte in Zebrafish allo Studio biliare-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of cyclic nucleotides. By modulating intracellular cyclic nucleotide concentration, MRP4 can regulate multiple cyclic nucleotide-dependent cellular events including cell migration. Previously, we demonstrated that in the absence of MRP4, fibroblast cells contain higher levels of intracellular cyclic nucleotides and can migrate faster. To understand the underlying mechanisms of this finding, we adopted a direct yet multifaceted approach. First, we isolated potential interacting protein complexes of MRP4 from a MRP4 over-expression cell system using immunoprecipitation followed by mass-spectrometry. After identifying unique proteins in the MRP4 interactome, we utilized Ingenuity Pathway Analysis (IPA) to explore the role of these protein-protein interactions in the context of signal transduction. We elucidated the potential role of the MRP4 protein complex in cell migration and identified F-actin as a major mediator of the effect of MRP4 on cell migration. This study also emphasized the role of cAMP and cGMP as key players in the migratory phenomena. Using high-content microscopy, we performed cell-migration assays and observed that the effect of MRP4 on fibroblast migration is completely abolished by disruption of the actin cytoskeleton or inhibition of cAMP-dependent kinase A (PKA). To visualize signaling modulations in a migrating cell in real time, we utilized a FRET-based sensor for measuring PKA activity and found, the presence of more polarized PKA activity near the leading edge of migrating Mrp4-/- fibroblast, compared to Mrp4+/+fibroblasts. This in turn increased cortical actin formation and augmented the process of migration. Our approach enables identification of the proteins acting downstream to MRP4 and provides us with an overview of the mechanism involved in MRP4-dependent regulation of fibroblast migration.

MRP4 regulates various cyclic nucleotide-dependent signaling events including a recently elucidated role in cell migration. We describe a direct, but multifaceted approach to unravel the downstream molecular targets of MRP4 resulting in identification of a unique MRP4 interactome that plays key roles in the fine-tuned regulation of fibroblast migration.

Metodi per studiare Mrp4 contenenti complessi macromolecolari nel regolamento di Fibroblasto migrazione

Multidrug resistance protein 4 (MRP4) is a member of the ATP-binding cassette family of membrane transporters and is an endogenous efflux transporter of ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualizzazione

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about the effect of natural uranium on the behavior of bone cells. In particular, the impact of uranium on osteoclasts, the cells responsible for the resorption of the bone matrix, is not documented. To investigate this issue, we have established a new protocol using uranyl acetate as a source of natural uranium and the murine RAW 264.7 cell line as a model of osteoclast precursors. Herein, we detailed all the assays required to test uranium cytotoxicity on osteoclast precursors and to evaluate its impact on the osteoclastogenesis and on the resorbing function of mature osteoclasts. The conditions we have developed, in particular for the preparation of uranyl-containing culture media and for the seeding of RAW 264.7 cells allow to obtain reliable and highly reproductive results. Moreover, we have optimized the use of software tools to facilitate the analysis of various parameters such as the size of osteoclasts or the percentage of resorbed matrix.

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium is known to affect bone metabolism. Here, we present a protocol aimed at investigating the effect of natural uranium exposure on the viability, the differentiation, and the function of osteoclasts, the cells in charge of bone resorption.

Metodi per analizzare gli impatti di uranio naturale il Osteoclastogenesis In Vitro

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...