We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

Nota: Per questo studio, le cellule stromali mesenchimali del polmone (LR-MSC) dal tessuto polmonare distale sono stati isolati sia in base alla loro espressione di marcatori di superficie cellulare (CD45 neg, CD31 neg, Sca-1 alto, EpCAM neg) 14,15, utilizzando espianto fuori crescita del 16, o tramite digestione enzimatica 17. Aderente LR-MSC sono state coltivate in DMEM con elevato glucosio e non glutammina, 15% FBS, glutammina antibiotici / antimicotici, e 2 mM 1x (ormai completo media) e incubato a 37 ° C, 5% CO 2. LR-MSC sono stati diversi passaggi 3-4 volte per garantire una popolazione di cellule con caratteristiche di crescita relativamente omogenei per il saggio di migrazione. 1. Preparare un Confluent monostrato <ol><li> Per staccare MSC da 100 mm di piatti standard della cultura, lavare le cellule con 10 ml di 37 ° C PBS preriscaldata, aspirare il PBS e aggiungere 4 ml di tripsina (0,25%). Incubare 3-5 minuti a 37 ° C incubatore. Aspirare il cells in una provetta conica, aggiungere uguale volume di mezzi completi e centrifugare a 300 g per 5 min a pellet le cellule. Nota: più lunga incubazione in tripsina può alterare i recettori di superficie delle cellule e potenzialmente influenzare la migrazione. </li><li> Aspirare i media e risospendere le cellule in mezzi freschi completo. Contare le cellule, escluse le cellule morte con trypan blue e piastra cellule stromali mesenchimali 500.000 in 4 ml di completo media su un piatto di coltura cellulare 60 mm. Nota: A seconda della fonte delle cellule, possono essere necessari per determinare il numero ottimale di cellule necessarie. </li><li> Incubare le cellule fino a quando le piastre sono il 90% confluenti per il fissaggio cellulare ottimale e la proliferazione, di solito 48-72 ore per MSC. Nota: 100% confluenza non è consigliabile, dato che molti di ancoraggio-dipendente contatto celle esperienza inibizione, che possono alterare la capacità migratoria. Piastre con meno del 80% di confluenza provocheranno foto inutilizzabili perché il software di analisi di immagine interpreterà gaps tra le cellule come parte del perimetro del graffio (vedi Figura 1D). </li><li> Dopo che le cellule hanno raggiunto il 90% di confluenza, danneggiare le cellule come appropriato per l&#39;applicazione. Per valutare il danno cellulare dopo l&#39;esposizione al fumo di sigaretta estratto solubile (CSE), generare il 100% CSE disegnando il fumo dal 1 Università del Kentucky sigaretta ricerche (3R4F) attraverso 25 ml di completo media in un pallone Büchner oltre 2 min 18. </li><li> Incubare le cellule per 24 ore in 4 ml 1-4% CSE diluito in completo dei media. Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule due volte con 4 ml di PBS sterile calda, prima della sostituzione con 4 ml mezzi freschi completo. Nota: le cellule distruttive ad alta concentrazione di estratto di fumo di sigaretta (&gt; 5%) può ridurre in modo sostanziale confluenza. </li></ol> 2. Creazione Scratch <ol><li> In un ambiente sterile, togliere il coperchio dalla piastra 60 millimetri di MSC danneggiati, e laici un regolo (per esempio, un righello di plastica sterilizzata) across il bordo superiore della piastra. Senza rimuovere il supporto, utilizzare una sterile 200 microlitri pipetta punta guidata dal straight-edge sterili per fare uno a quattro graffi paralleli in tutto il piatto circa 5 mm di distanza e 50 mm di lunghezza. Nota: Un regolo minimizza la quantità di rotazione necessari adeguamenti alla piastra quando è sul palco microscopio. È indispensabile che i graffi appaiono completamente verticale (o orizzontale) sullo schermo. Generazione multipli graffi su una piastra 60 mm non altera il microambiente in modo che colpisce la migrazione cellulare (dati non mostrati), ma può essere una considerazione per altri tipi di cellule. L&#39;uso dei pozzi più piccoli non è raccomandato in quanto la variabilità delle cellule cresce vicino al bordo del pozzo diventa più pronunciato e può interessare generazione uniforme dei graffi. </li><li> Aspirare media e lavare delicatamente le piastre con 2 ml di mezzi completi pre-riscaldato per impedire cellule di aderire al centro del graffio, e per rimuovere cellules che sono stati allentato dal graffio. Sostituire con 4 ml di mezzi freschi completo. </li><li> Utilizzando un pennarello indelebile sterile, etichettare ogni graffio da 1-4 sul lato inferiore della piastra in posizione che non interferiscono con le immagini dei graffi. Nota: E &#39;importante che le immagini della stessa zero vengono confrontati prima e dopo la migrazione, poiché non vi può essere la variazione a larghezza zero. </li></ol> 3. Prendendo iniziali Immagini Scratch Nota: Se il test scratch viene eseguita su piastre multiple, si raccomanda che siano prese immagini iniziali di tutti i graffi su un singolo piatto prima graffi sono effettuati sulla piastra successiva. <ol><li> Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito con una macchina per generare le immagini necessarie per l&#39;analisi. </li><li> Posizionare la piastra di coltura sul microscopio, e utilizzare l&#39;obiettivo di bassa potenza (10X) per individuare zero # 1. Se la formazione di condensa sul coperchio della piastra di coltura sta impedendo una chiara image delle cellule, utilizzare un palcoscenico riscaldata a 37 ° C. </li><li> Mantenendo il graffio completamente orizzontale e nel centro del campo di vista, ottenere più immagini come necessario comprenda 90% della lunghezza della graffiatura. Ottenere immagini di porzioni distinte della zero con alcuna sovrapposizione tra le immagini. Nota: La rifrazione della luce ai bordi del piatto cultura sovraespone le immagini, rendendole impossibile analizzare. Pertanto, non prendere le immagini dal primo e l&#39;ultimo 5% della lunghezza della zero. </li><li> Salvare le immagini da ogni zero in una cartella separata. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,4 per graffi 2, 3, e 4. </li><li> Piastre per l&#39;incubatore restituire immediatamente dopo l&#39;imaging iniziale. Lasciate che le cellule migrano per 4-7 ore. Nota: 7 ore è ottimale quando si valuta MSC danneggiate con CSE. Incubando le cellule per più di 7 ore non è raccomandato perché la proliferazione cellulare può fungere da variabili di confondimento per la migrazione cellulare (vedi nota Opzionale 8.2 sotto). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analizzando iniziali Scratch Immagini <ol><li> Scaricare ImageJ e installare il plugin di Wound Healing Tool (fare riferimento alla tabella dei materiali / attrezzature). </li><li> Aprire il file di immagine in ImageJ, quindi fare clic su &quot;Processo&quot; e &quot;Trova bordi&quot; per evidenziare le cellule circostanti il graffio per la guarigione della ferita strumento per calcolare l&#39;area zero (Figura 2B). Quindi, fai clic su &quot;Immagine&quot;, &quot;Regola&quot;, &quot;Soglia colori&quot; e nel menu a discesa con l&#39;etichetta &quot;Soglia colori&quot; modificare il valore di &quot;B &amp; W&quot;. </li><li> All&#39;interno del menu &quot;Soglia colori&quot;, regolare entrambi i cursori soglia di luminosità fino a raggiungere ottimale contrasto tra il graffio e la cella di fronte. Per consentire la massima gamma nel tentativo di creare contrasto nell&#39;immagine, spostare completamente il cursore inferiore a destra (immagine completamente nera), e quindi regolare il cursore superiore per generare il massimo contrasto. </li><li> Lentamente regolare la BRI superioreghtness cursore da sinistra verso destra fino a quando l&#39;immagine viene visualizzata in modo pulito il contorno del graffio (Figura 2C). Una volta che sono stati identificati i bordi del graffio, fare clic su &quot;Altre Strumenti&quot; nella barra degli strumenti ImageJ, selezionare &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; dal menu a discesa, e premere il tasto &quot;m&quot; (che apparirà nella barra degli strumenti ImageJ) per evidenziare l&#39;area scratch e l&#39;uscita dell&#39;area calcolata in un risultato finestra a comparsa (figura 2D). </li><li> Copia e incolla tutti i numeri dalla finestra dei risultati (Figura 2E) in un foglio di calcolo Excel. Assicurati di separare i dati dai singoli graffi. </li></ol> 5. Prendendo finali Immagini Scratch <ol><li> Dopo che le cellule sono migrate (4-7 ore), ripetere i passaggi 3,2-3,4. Immagine le piastre nello stesso ordine in cui sono stati graffiato in modo che le cellule su ogni piatto hanno avuto uguale tempo di migrare. Nota: Le celle possono essere esposte in più punti di tempo, a seconda della loro sensitività a cambiamenti di temperatura e di pH. In alternativa, l&#39;imaging cellulare dal vivo può essere usato per seguire le cellule in tempo reale durante la loro migrazione. </li></ol> 6. Analisi finali Scratch Immagini <ol><li> Ripetere i passaggi 4,2-4,5 per le immagini e vinci finali. </li></ol> 7. calcolo dell&#39;area Scratch per quantificare la migrazione <ol><li> Calcolare l&#39;area di pre-migrazione media dalla media dei valori dell&#39;area iniziali dei rispettivi graffi. </li><li> Calcolare la quantità totale di migrazione sottraendo l&#39;area di migrazione finale per ogni immagine, calcolata al punto 6, dalla zona di pre-migrazione media (passo 7,1). Generare un elenco di valori per ciascun zero rappresenta la variazione nella migrazione. </li><li> Pool i dati da più graffi all&#39;interno dello stesso gruppo di prova (vale a dire tutti i piatti e tutti i graffi sulle cellule esposte a 0% CSE). Utilizzare una analisi della varianza di test per analizzare le differenze tra i gruppi sperimentali. </li><li> Se le cellule sono lenti a migraree richiedono un tempo di incubazione più lungo dopo graffi (maggiore di 10-12 ore), eseguono un BrDU o EdU incorporazione dosaggio 19 per determinare se le cellule stanno subendo qualsiasi proliferazione durante il periodo in cui il test di migrazione è in corso. Scegli un tempo saggio di migrazione per evitare significativa proliferazione cellulare. </li></ol> 8. Facoltativo <ol><li> Per valutare se significativo senescenza cellulare si verifica come risultato della procedura di graffi, eseguire una senescenza associata Beta-galattosidasi test su una piastra di prova in un momento predeterminato dopo graffi 19. </li></ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+sedimentation+on+measuring+chondrocyte+population+migration+using+a+Boyden+chamber.">The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber.</a> J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).</li><li>Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lymphocyte+traffic+by+adhesion+molecules.">Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules.</a> Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).</li><li>Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigidity-driven+growth+and+migration+of+epithelial+cells+on+microstructured+anisotropic+substrates.">Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).</li><li>Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Dependence+of+Lung+Mesenchymal+Stromal+Cell+Dynamics+Following+Pneumonectomy.">Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy.</a> Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).</li><li>McQualter, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cell+Post-Transplantation+Survival,+Persistence,+Paracrine+Expression,+and+Repair+of+Elastase-Injured+Lung.">Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).</li><li>Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+biomarkers+of+cellular+senescence:+the+senescence-associated+beta-galactosidase+assay.">Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay.</a> Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo quantitativo robusto, standardizzato per eseguire ed analizzare saggi di scratch. Saggi scratch semplici sono abitualmente utilizzati in diversi settori di studio per esaminare la migrazione cellulare. Tuttavia, tradizionalmente il dosaggio zero è mancato un set-up e la quantificazione protocollo standardizzato, che ha portato a problemi con riproducibilità 7,10. Molte delle modifiche e ottimizzazioni per migliorare il dosaggio zero hanno ridotto questi problem...

La migrazione cellulare è altamente coordinato e vitale in molti processi fisiologici quali lo sviluppo dei tessuti, la riparazione e la rigenerazione, nonché processi patologici quali metastasi del cancro e l&#39;arteriosclerosi 1. Una comprensione della migrazione delle cellule è particolarmente rilevante per terapie emergenti utilizzati per riparare i tessuti danneggiati e il trattamento di condizioni patologiche, comprese le tecnologie di trapianto di cellule e tessuti artificiali di innesto 2. Dato l&#39;attuale interesse per il ruolo delle cellule stromali mesenchimali (MSC) nella mediazione riparazione dei tessuti 3, quantificare la capacità migratoria di queste cellule utilizzando un metodo che è rigorosamente quantificabile, adattabile, e conveniente è di interesse. È importante sottolineare che un tale test deve essere sufficientemente sensibile per rilevare i cambiamenti relativamente sottili cellulare capacità migratoria dopo un danno. Gli attuali metodi per quantificare la migrazione delle cellule, tra cui saggi e vinci, trans pozzetti test di migrazione (Boyden chambre), array micropillar, e saggi zona di esclusione cellulare in possesso di una serie di limitazioni nella riproducibilità, personalizzazione, la quantificazione, e costo-efficacia 1,4,5. Il test zero ottimizzata qui descritto dimostra esiti robuste capacità di analisi quantificabili e basati su immagini, costo-efficacia, e l&#39;adattabilità ad altre applicazioni. Scratch saggi sono stati utilizzati in molteplici capacità di valutare la migrazione cellulare e la proliferazione in diverse condizioni sperimentali 5. Il test prevede la semina le cellule designate, crescendo loro di completare o nei pressi di confluenza, e graffiare il monostrato risultante con un ago sterile o pipetta punta 6. Analisi è più comunemente effettuata confrontando la larghezza del graffio su più punti di tempo in luoghi selezionati casualmente 7-9. Nonostante il suo uso prominente, il dosaggio zero è confuso da problemi con la riproducibilità e la quantificazione. Variabilità ingenerazione del graffio non solo modificando il microambiente delle cellule, ma può anche impedire la migrazione delle cellule danneggiando la superficie sottostante piastra e extracellulare matrice 5. I saggi sono spesso condotti per 7-12 ore, ma per linee cellulari che mostrano una migrazione più lenta e tempi di analisi più lunghi, la proliferazione diventa una variabile confondente 7,10. Infine, le cellule senescenti generati dal processo di graffiare può rilasciare fattori che interferiscono con la segnalazione extracellulare necessaria per colmare il divario in monostrato 1. Ottimizzazione dosaggio zero richiede la creazione di un vuoto costante che non interferisce con le proprietà superficiali, minimizzando dosaggio lunghezza di tempo, e prevenire la morte delle cellule indesiderate durante la manipolazione. Il saggio basato tappo è una ottimizzazione di un saggio zona di esclusione cellule. Questo saggio utilizza un tappo posto al centro del pozzo che esclude la crescita cellulare, ma permette alle cellule di essere placcato intorno alla zona di esclusione centrale.Per valutare la migrazione, il tappo viene rimosso, e la zona di esclusione risultante fornisce una superficie per la migrazione a verificarsi. Tuttavia, questo test è difficile da personalizzare o adattare 10 e per alcune applicazioni, questa tecnica può anche essere costo proibitivo. In contrasto con saggi graffiatura e loro derivati, saggi di migrazione trans-well (o camera di Boyden saggi) valutano la migrazione quantificando il numero di celle che si muovono da una camera, attraverso una membrana microporosa filtro, in una camera contenente agenti chemiotattici 8,11, 12. Questa tecnica ha limitato l&#39;utilità di cellule aderenti come MSC perché dopo la migrazione attraverso la membrana porosa, le cellule aderiscono al lato della membrana esposta agli agenti chemiotattici, e può essere difficile da quantificare con precisione. Mentre il test è in grado di esaminare alcuni modelli di migrazione tridimensionali, i tipi di cellule ristrette per il quale è in grado di quantificare accuratamente limite migrazione cellulare sua utilità 10. Un&#39;altra alternativa per saggi scratch utilizza una matrice di micro-pilastro, che misura la motilità cellulare attraverso uno spazio tridimensionale utilizzando la capacità delle cellule di deformarsi e migrare nella matrice come un surrogato. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomeri curati su uno stampo preciso e trattati con ozono e fibronectina produce un microambiente omogeneo e non degradabile. Spaziatura Micro-pilastro può anche essere variata come necessario per misurare la capacità delle cellule di entrare nella matrice 4. Lo stampo viene creato attraverso profonda ioni reattivi di wafer di silicio per creare una versione negativa di alta con formato matrice 13. Mentre l&#39;analisi è rafforzata dalla sua personalizzazione, capacità di modellare la migrazione tridimensionale, e l&#39;analisi attraverso la visualizzazione diretta delle cellule migranti, difficoltà nella creazione di array di micro-pilastro ostacola economicamente la sua diffusione. Il dosaggio zero ottimizzata descritto in questo protocollo offre un efficiente, cosMetodo t-efficace per produrre graffi coerenti che possono essere analizzati utilizzando il software liberamente disponibile. Invece di semplici misure di larghezza effettuate attraverso il graffio prima e dopo la migrazione delle cellule, il software permette all&#39;utente di determinare le aree totali scratch prima e dopo la migrazione. Tale avanzamento limita il problema di cercare di determinare dove il graffio opportuno prendere le misure di larghezza, e se la larghezza del graffio è uniforme lungo la sua lunghezza. Inoltre, attenta ottimizzazione di numero di cellule, cellule confluenza e il tipo e grado di danno inflitto sulle cellule è discusso per ottimizzare ulteriormente il dosaggio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

I saggi e vinci qui presentati sono stati eseguiti utilizzando cellule mesenchimali stromali residenti polmone murini (LR-MSC) e isolate come riferito nelle note di protocollo. La LR-MSC sono state seminate ad una densità di 500.000 cellule in un piatto di coltura di tessuti 60 mm, e cresciuto a 90% di confluenza in 48 ore. Per generare danni, 4% CSE (descritto sopra) è stato incubato con le cellule per 24 ore dopo il periodo di semina iniziale, ma prima del dosaggio zero. Per ogni test, il graffio è stata generata u...

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.8K Views.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Valutazione della migrazione delle cellule endoteliali dopo l&#39;esposizione a sostanze chimiche tossiche

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Un test a blot di 5 mc quantificando il livello di metilazione del DNA della dedifferentiation di condrociti<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

L'analisi di co-coltura di anello aortico: Un comodo strumento per valutare il potenziale angiogenico delle cellule stromali mesenchimali In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...