In questo metodo, la forza viene applicata direttamente al nucleo. Questo disaccoppia l'effetto di trasmissione della forza dalla membrana plasmatica cellulare e dal citoscheletro, rivelando i meccanismi molecolari del meccanorilevamento nucleare. La forza viene applicata all'interno delle cellule viventi in modo non invasivo.
Rispetto alle pinzette ottiche, il campo magnetico e la forza magnetica non influenzano le funzioni della cella e hanno un throughput più elevato. Iniziare a coltivare le cellule con microsfere magnetiche pesando 0,2 grammi di microsfere di ferro carbonile con sette micrometri di diametro medio. Sospendete le microsfere in un terreno di coltura RPMI 1640 da un millilitro utilizzando una pipetta.
Quindi portare la capsula di Petri con cellule B2B nell'armadio di biosicurezza e aggiungere rapidamente 200 microlitri del mezzo contenente microsfere nella capsula di Petri. Metti la capsula di Petri in un'incubatrice fino a quando le microsfere non vengono interiorizzate dalle cellule. Aprire il microscopio invertito e utilizzando l'imaging a fluorescenza confocale, determinare il momento ottimale per l'internalizzazione delle linee cellulari ogni sei ore visualizzando il confine della microsfera, del nucleare e della cellula.
Le microsfere internalizzate saranno presenti all'interno del confine cellulare. Per l'applicazione di piccole forze e l'imaging di cellule vive, aprire l'applicazione software Elements. Per definire la configurazione del rilevamento magnetico, fare clic sul pulsante uno su due per impostare la velocità di scansione su un fotogramma ogni due secondi.
Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1,2 unità Airy. Controllare solo il canale FITC e impostare PMT HV su 70, offset come zero, intensità laser su 10. Per definire il nucleo YAP magnetico di configurazione, impostare la velocità di scansione su un fotogramma ogni quattro secondi facendo clic sul pulsante uno su quattro.
Quindi fare clic sul pulsante 1.2 Airy unit per impostare la dimensione del foro stenopeico su 1.2 Airy unit e controllare il canale FITC. Impostare PMT HV come 70, offset come zero, intensità laser come 10. Per l'imaging del confine del nucleo e dell'intensità della colorazione nucleare, controllare il canale cianina 5.
Non fare clic sul pulsante 1.2 Airy unit e impostare PMT HV su 70, offset a zero e intensità laser a 10. La dimensione del foro stenopeico sarà ottimizzata per l'imaging tridimensionale delle proteine associate a YES. Quindi, attiva la DIA tramite Elements.
Aprire la vista di rotazione, utilizzare un campo luminoso e regolare la messa a fuoco dell'oggetto per ottenere un'immagine chiara delle celle. Usa un obiettivo 10X per trovare più celle singole appropriate in tre condizioni, ad esempio una cella con una singola microsfere all'interno, con più microsfere all'interno e senza alcuna microsfere all'interno. Quindi passare all'obiettivo 40X e nominare questa posizione con il numero di posizione appropriato.
Apri Elementi, fai clic su Trova magnetico, rimuovi interblocco, quindi scansiona le schede, quindi seleziona i pulsanti superiore e inferiore per regolare la posizione Z del piano focale per impostare il limite inferiore e superiore per la pila Z delle celle selezionate. Interrompere la scansione facendo nuovamente clic su Scansione. Passare alla configurazione del nucleo YAP magnetico e impostare il nome del file come before_small_force.nd2.
Fare clic sul pulsante Esegui con lo stack Z registrato. Passare al percorso della luce corretto e attivare DIA. Apri la vista di rotazione e fai clic sul pulsante di registrazione.
Spostare il magnete a 46 millimetri sopra il fondo della capsula di Petri ruotando la manopola del dispositivo di movimento del magnete. Salva e controlla il video per confermare lo spostamento delle microsfere indotto dalla forza magnetica. Ripetere la procedura di scansione impostando il nome del file come after_small_force.nd2.
Quindi, passare al percorso della luce destro, attivare DIA e aprire la vista di rotazione prima di fare clic sul pulsante di registrazione. Ruotare la manopola del dispositivo mobile magnetico fino a 120 millimetri sopra il fondo della piastra di Petri e salvare una sequenza di immagini o video a campo chiaro. Ripetere i passaggi per la scansione impostando il nome del file su before_large_force.nd2.
Le microsfere non possono emettere fluorescenza sotto eccitazione laser nel canale FITC o cianina 5. Pertanto, le microsfere internalizzate sono state identificate dalla cavità scura situata nell'imaging confocale della fluorescenza della proteina e del nucleo associati a YES. La circolarità nucleare non ha mostrato differenze significative tra le cellule di controllo e le cellule con internalizzazione delle microsfere.
Anche il rapporto nucleo-citoplasma delle cellule proteiche associate a YES-cellule di controllo co-coltivate con microsfere ma senza internalizzazione e cellule con internalizzazione di microsfere non ha mostrato differenze significative. La deformazione del nucleo e la depolimerizzazione dell'actina sono state causate dalla forza di compressione applicata dalle microsfere nelle cellule contenenti citoscheletro. La curva di calibrazione dell'analisi quantitativa dell'imaging fornita dalla relazione quantitativa di spostamento della forza AFM.
Sulla base di questa relazione, è stata stimata la forza applicata alle perline. La deformazione del nucleo e la traslocazione proteica associata a YES sono state osservate all'applicazione o al rilascio della forza magnetica. I cambiamenti di intensità nella proteina associata a YES nel canale verde e nessun cambiamento nella colorazione del nucleo nel canale rosso hanno confermato che la deformazione nucleare indotta dalla forza magnetica innescata dalla traslocazione della proteina associata a YES.
La quantificazione della variazione netta del rapporto nucleo-citoplasma della proteina associata a YES-all'interno di due gruppi ha confermato che la forza magnetica applicata alle microsfere all'interno del citoplasma ha indotto la traslocazione proteica associata a YES-e ha modificato il rapporto nucleo-citoplasma della proteina associata a YES. Prima di applicare la forza e l'imaging, assicurarsi che le cellule abbiano interiorizzato le microsfere magnetiche e che le perle siano all'interno del confine cellulare.
