Plasmodiophora brassicae è il patogeno biotrofico obbligatorio trasmesso dal suolo che attacca le piante della famiglia delle Brassicaceae. Dopo l'infezione, l'agente patogeno innesca lo sviluppo di galle sulle parti sotterranee della pianta, da cui il nome della radice del club della malattia. Lo sviluppo delle galle è accompagnato da una riprogrammazione molto complessa.
Pertanto, la possibilità di tracciare i cambiamenti interni durante la malattia è fondamentale per comprendere questa interazione pianta-patogeno. Il nostro protocollo migliora l'imaging di complessi, spessi e galle. Facilita la visualizzazione dei cambiamenti nell'espressione genica, nelle risposte fisiologiche, nell'equilibrio fitoormonale, nella progressione della malattia, nella distribuzione delle spore e nella lignificazione locale.
Il protocollo conserva le proteine fluorescenti all'interno dei campioni, consentendo la conservazione e l'elaborazione degli oggetti per lungo tempo. Consente inoltre di monitorare i cambiamenti biochimici e strutturali che accompagnano la progressione della malattia. A dimostrare la procedura saranno Sara Blicharz, ricercatrice post-dottorato nel nostro gruppo, Deeksha Singh, dottoranda del nostro laboratorio, e Kornel Michalak, dottoranda del gruppo della professoressa Agnieszka Bagniewska-Zadworna presso l'Università Adam Mickiewicz.
Inizia preparando il tessuto vegetale. Rimuovere con cura il terreno dai sistemi radicali delle piante infette e non infette da clubroot. Pulire accuratamente con acqua e raccogliere ipocotili e galle in tubi di microcentrifuga.
Fissare i campioni in 200-500 microlitri di fissativo paraformaldeide per un'ora a temperatura ambiente applicando un vuoto costante di 700 millibar utilizzando una pompa per vuoto. Assicurarsi che l'oggetto sia completamente immerso nella soluzione di paraformaldeide. Utilizzare il 4% di agarosio per incorporare ipocotili non infetti e galle infette.
Far bollire la soluzione per sciogliere l'agarosio e versarla quando si raffredda mentre è ancora viscosa. Asciugare leggermente l'oggetto su un fazzoletto per alcuni secondi per rimuovere l'eccesso di paraformaldeide. Usa stuzzicadenti o pinze per incorporare e orientare attentamente l'oggetto vegetale nell'agarosio.
Per evitare sezioni oblique, assicuratevi che l'oggetto sia orientato e modellato correttamente in modo che il suo asse sia perpendicolare al piano della lama della vibratomia. Per accelerare la solidificazione dell'agarosio, posizionare una piastra di Petri o multicoltura a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Utilizzando una lama, tagliare e modellare con cura l'oggetto all'interno di un blocco di agarosio, notando l'orientamento preferito per il sezionamento.
Attaccare il blocco di agarosio o il fiele grande per montarlo correttamente sul supporto del campione utilizzando cianoacrilato o colla istantanea e nastro adesivo. Regola lo spessore per le sezioni, la velocità e l'ampiezza della vibrazione in base allo spessore e alle dimensioni della galleria. Aggiungere acqua distillata al bagnomaria e iniziare con il sezionamento.
Raccogliere con cura le sezioni con una pinza o un pennello e trasferirle in un tubo di microcentrifuga contenente un millilitro di tampone PBS 1X. Rimuovere 1X PBS dal tubo della microcentrifuga e aggiungere da 200 a 500 microlitri di soluzione di pulizia. Sostituire la soluzione di compensazione con quella nuova se il suo colore cambia dopo un po 'di tempo durante l'elaborazione del campione.
Eseguire la colorazione bianco calcofluor per le pareti cellulari delle cellule vegetali di copertura preparando il 5% di colorazione bianca calcofluor nella soluzione di pulizia. Quindi macchiare le cellule al buio per almeno cinque minuti. Colorare i lipidi con rosso Nilo e le lignine con colorazione basica della lignina Fuchsin come descritto nel manoscritto testuale e montare le sezioni cancellate sul vetrino da microscopia.
Quindi osservare le cellule sotto un'epifluorescenza o un microscopio confocale. Utilizzare più modalità di acquisizione per l'imaging simultaneo di più di uno spettro di fluorescenza. La dinamica della malattia e l'accumulo di patogeni sono stati monitorati nelle galle colonizzate da Plasmodiophora brassicae, e sono state osservate grandi cellule con spore a riposo di P. brassicae dopo la colorazione rossa del Nilo.
I cambiamenti nella differenziazione dello xilema dopo l'infezione da P.brassicae sono stati visualizzati utilizzando la colorazione Fuchsin di base. Le piante di Arabidopsis che ospitano il costrutto pHCA2:erRFP sono state utilizzate per visualizzare l'espressione genica HCA2 nel tessuto floematico all'interno delle galle clubroot. HCA2 co-localizzato con il floema nelle ultime fasi dello sviluppo del fiele guidato da P.brassicae e l'attività genica riflette il meccanismo attraverso il quale P.brassicae aumenta la complessità del floema.
A 16 giorni dopo l'inoculazione, le risposte differenziali delle citochinine tra piante infette e non infette sono state valutate controllando l'espressione del marcatore TCS:GFP nelle galle in via di sviluppo. Le risposte della citochinina sembrano essere significativamente diminuite nelle galle infette, mentre sono rimaste forti, specialmente nel pool floematico, nelle piante non infette. I passaggi più critici sono la fissazione in PFA, l'incorporamento e il sezionamento.
Per il sezionamento della vibratomia, è necessario ottimizzare e regolare attentamente i parametri di velocità, ampiezza e spessore per ottenere sezioni di buona qualità. Le tecniche di sezionamento del vibratomo e di pulizia dei tessuti hanno spianato la strada al miglioramento dell'analisi microscopica delle risposte fisiologiche durante le interazioni pianta-microbo e dei tessuti che mostrano una crescita secondaria con anatomia cellulare complessa.
