Questo protocollo è significativo perché è, per quanto ne sappiamo, il primo a descrivere un nuovo metallo a base di centrifuga per la purificazione cinetica dei polisomi dai noduli simbiotici della soia. Il grande vantaggio di questa tecnica è che in combinazione con RNA-Seq, permette lo studio della relazione e organizzato in un tessuto complesso come il nodulo simbiotico. Per iniziare, pesare circa 0,2 grammi di noduli intatti in un piatto di pesata e trasferirli in un tubo da due millilitri pre-raffreddato.
Quindi aggiungere 1,2 millilitri di tampone di estrazione dei polisomi, lasciare scongelare il campione per due minuti e omogeneizzare con una smerigliatrice tissutale fino alla completa rottura e omogeneizzazione dei noduli. Quindi, incubare i campioni su ghiaccio con delicata agitazione per 10 minuti o fino a quando tutti i campioni sono stati elaborati e centrifugare a 16.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i detriti. Quindi, recuperare il surnatante e ripetere il passaggio della centrifuga.
Dopo aver accuratamente recuperato l'estratto citosolico chiarificato, trasferire un'aliquota da 200 microlitri in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri per un isolamento totale. Quindi, versare 4,5 millilitri dello strato di saccarosio al 33,5% nelle provette della centrifuga e aggiungere 4,5 millilitri dello strato del 12% con attenzione e lentamente con una micropipetta P-1000. Quindi, mettere i tubi sul ghiaccio fino all'aggiunta dell'estratto citosolico chiarificato.
Caricare un millilitro dell'estratto citosolico chiarificato sulla parte superiore del cuscino di saccarosio mediante pipettaggio accurato sulla parete laterale del tubo. Quindi, trasferire i tubi ultra centrifuga in secchi pre-raffreddati e centrifugare a 217, 874 G per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato l'estratto citosolico rimanente e il cuscino di saccarosio, risospendere il pellet polisomiale con 200 microlitri di tampone di risospensione preraffreddato.
Quindi, incubare per 30 minuti su ghiaccio, quindi trasferire la risospensione polisomiale in tubi pre-raffreddati da 1,5 millilitri per procedere con l'estrazione dell'RNA. Dopo aver omogeneizzato i campioni con 750 microlitri del reagente di isolamento dell'RNA incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio freddo e agitare vigorosamente i tubi per 15 secondi.
Quindi, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per la separazione di fase e trasferire 500 microlitri della fase acquosa superiore in un tubo pulito senza disturbare la fase organica rosa. Quindi, aggiungere 375 microlitri di isopropanolo freddo e 0,5 microlitri di glicogeno libero RNA.
Successivamente, mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare la miscela per 10 minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare a 12.000 volte G per 15 minuti. Quindi, scartare il surnatante e lavare il precipitato di RNA con un millilitro di etanolo freddo al 75%.
Mescolare per breve vortice. Quindi, centrifugare a 7.500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet di RNA.
Quindi, sciogliere il pellet in 50 microlitri di acqua libera da RNA e incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Valutare la concentrazione e l'integrità dell'RNA con elettroforesi capillare altamente sensibile e/o elettroforesi su un gel di agarosio libero al 2%. Dopo aver stimato il volume del campione, aggiungere 0,1 volumi di tre molari di acetato di sodio, tre volumi di etanolo freddo e 0,5 microlitri di RNA, glicogeno libero.
Quindi, mescolarli accuratamente. L'elettroforesi capillare è stata eseguita per diverse frazioni di campione di RNA associate totali e polisomiali, che hanno dimostrato bande di RNA ribosomiale affilate, senza alcun aspetto spalmato. Tuttavia, ciò non si riflette nei valori RIN, poiché variano tra 5,9 e 7,5, che corrisponde a campioni non intatti.
Il bioanalizzatore non è riuscito a identificare i picchi 18S e 25S come si vede negli elettroferogrammi, sia per campioni di RNA totali che associati ai polisomi. Non c'era alcun segno visivo di degradazione del campione. Tuttavia, un campione è stato analizzato per visualizzare il risultato di un campione quasi interamente degradato, per il confronto.
La cosa più importante è lavorare in condizioni di conservazione dei polisomi e dell'RNA durante l'intero protocollo. Dopo aver sequenziato le frazioni totali e par RNA, i modelli standard per l'espressione genica analizzata possono essere utilizzati per identificare geni differenziali espressi a livello di trascrizione e traduzione.
